苯丙氨酸生物合成通路多酶基因协同表达的研究

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1、摘要苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）是人体所需的必需氨基酸，在医学、营养学、食品加工及动物饲养领域均有应用。苯丙氨酸还是生产甜味剂阿斯巴甜（Aspartame）的关键原料，目前市场需求日益增加。我国缺乏先进高效的L-苯丙氨酸（L-Phe）生产技术，主要依靠进口，因此利用分子生物学技术构建L-苯丙氨酸高产工程菌具有现实意义。本研究通过设计、优化酶基因的间隔调控序列（Intergenicregulatorysequence），使L-Phe生物合成代谢通路上下游的关键酶基因pheA、aroF和ppsA协同表达，从而达到提高L-Phe产量：⑴分别设计酶基因pheA、aroF和ppsA的调

2、控序列，构建单基因重组质粒，其中成功构建的重组子pTrc-99a-pheA，pTrc-99a-aroF单基因酶蛋白获得高表达；⑵构建pheA和aroF酶基因串联重组质粒pZE12-AF，改变两个串联基因间隔调控序列后得到了重组子pZE12-RBS-AF，将这两个重组质粒转入营养缺陷菌MG△pheA…aroF中，成功构建了工程菌MG△pZE12-AF和MG△pZE12-RBS-AF；⑶构建三个酶基因pheA、aroF和ppsA串联重组质粒pZE12-AFP，调整ppsA的调控序列后的重组子pZE12-RBS-AFP，并成功构建相应工程菌MG△pZE12-AFP和MG△pZE12-RBS-AFP。

3、利用SDS-PAGE观测酶蛋白表达量，调整多酶基因AF的间隔调控序列，二基因重组质粒pZE12-RBS-AF的酶蛋白比pZE12-AF表达量高；同样，AFP三基因重组质粒中，pZE12-RBS-AFP质粒调整了ppsA的间隔调控序列，酶蛋白比pZE12-AFP表达量也明显增多。测定工程菌发酵培养液上清中L-Phe的含量，MG△pZE12-RBS-AF工程菌L-Phe的产量比MG△pZE12-AF提高了1.5倍；MG△pZE12-RBS-AFP的产量比MG△pZE12-AFP也提高了2倍。MG△pZE12-RBS-AFP菌L-Phe的产量是MG△pZE12-RBS-AF的1.2倍。实现了L-Ph

4、e生物合成中关键酶基因pheA、aroF和ppsA协同、匹配表达，代谢流显著流向终产物L-Phe，表明调整串联酶基因的间隔调控序列是改变代谢流及提高L-Phe的产量的一种有效方法。此外，选用低拷贝的pZE12质粒作为表达载体比高拷贝质粒（例如pTrc-99a）酶表达更适度而稳定，并不易形成包涵体和活性更高。关键词:L-苯丙氨酸；多酶基因；间隔调控序列；协同表达；生物合成StudiesonCoordinatedExpressionofMultienzyme-genesinPhenylalanineBiosynthesisPathwayAbstractPhenylalanine(Phe),bein

5、goneoftheessentialaminoacid,hasbeenwidelyutilizedinmedicine,nutrition,foodandfeedindustry,especially,L-Pheisoneofkeymaterialforsynthesisofaspartame,asweetenerutilizedinmass,themarketdemandisincreasing.However,forlackofadvancedandefficienttechnologyforproduction,L-Phedemandofourcountrymainlyrelyonimp

6、orts,thusthestudiesondevelopmentofengineeringbacteriastrainsforL-Pheproductionisofgreatpracticalsignificance.ToimprovetheyieldofL-PheproducingEngineeringBacteria,coordinateexpressionofthekeyenzymesgenes,pheA,aroFandppsA,thatinvolvedinL-Phebiosynthesispathwaywerestudiedasfollows:[1]Regulatorysequence

7、ofenzymegenepheA,aroFandppsAwasdesignedandoptimizedrespectivelyandsinglerecombinantplasmidswasconstructedseparatelytoachievehighexpressionofcorrelatingenzymeprotein.[2]RecombinantplasmidspZE12-AFandpZ