《子克隆的载体》PPT课件.ppt

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1、第三章分子克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体或病毒DNA考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征载体的定义载体的功能及特征将外源DNA或基因携带入宿主细胞的工具称为载体(vector)载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件载体的特征分子较小，可携带比较大的DNA片段。能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）。有合适的选择标记，易于筛选

2、。有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。基因克隆利用重组DNA技术分离目的基因，称为基因克隆(geneclone)克隆(clone)动词：指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程。名词：指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的群体。基因文库genelibrary由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群体，称为基因文库(genelibrary)功能

3、克隆载体:克隆一个基因或DNA片段表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中载体的分类来源：质粒载体plasmid噬菌体载体phage柯斯质粒载体cosmid真核细胞克隆载体载体的种类和特征载体种类受体细胞结构插入片断举例质粒*E.coli环状＜8*pUC18/19,T-载体pGEM-3z等λ噬菌体E.coli线状9-24kbEMBL系列，λgt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状＜10kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(Bacteria

4、lArtificialChromosome)E.coli环状≈300kbPeloBAC系列PAC(P1-derivedArtificialchromosome)E.coli环状100-2000kbPCYPAC1YAC(YeastArtificialchromosome)酵母细胞线性染色体100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳类细胞线性染色体＞1000kb病毒载体动物细胞环状SV40载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒第一节质粒（plasmid）载体质粒是一种

5、独立于染色体外的遗传因子，可自身复制和表达（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）一、质粒的基本特征大多数为超螺旋的双链共价闭合环状分子DNA(coverlentlyclosedcircleDNA,cccDNA),少数为线性大小为1-200kb，也有更大1.质粒的基本概念常见于原核细菌和真菌中一、质粒的基本特征质粒的表型：抗生素的抗性，产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒素）、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀虫等克隆的质粒载体允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。基因表达的质粒载体允许外源DNA的插入、储存和表达。质粒

6、DNA的构型：SC型共价闭合环形DNA（cccDNA）OC型开环DNA（（opencircularDNA,ocDNA）L型线性DNA（linearDNA,LDNA）作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因（replicator）选择性记号克隆位点LOCSC2.质粒的基本特征1）质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：松弛型复制控制的质粒10-60拷贝relaxedplasmid严紧型复制控制的质粒1-3拷贝string

7、entplasmid2）质粒的不相容性plasmidsincompatibility是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时出现的现象。质粒的不相容性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，

8、一般具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现30多个不相容群，如Co