科技职业学院教案（第页）.doc

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1、科技职业学院教案（第页）课题综合实训三：锌盐沉析法提取胰岛素教学要点与目标1.了解胰岛素锌盐沉析法制备的基本原理；2.掌握多肽及蛋白质类生化物质提取纯化的基本操作技术。教具与材料自编《生物分离技术实训指导书》教学内容与设计：组织教学：点名，检查学生的出勤人数1min实验导入：胰岛素有何特点？2min综合实训三：锌盐沉析法提取胰岛素一、目的要求1.了解胰岛素锌盐沉析法制备的基本原理；2.掌握多肽及蛋白质类生化物质提取纯化的基本操作技术。二、实验原理胰岛素是迄今为止治疗胰岛素依赖性糖尿病的特效药物。胰

2、岛素广泛存在于人和动物的胰脏中。其等电点为5.30～5.35，在pH4.5～6.5范围内几乎不溶于水，易溶于稀酸或稀碱溶液；在80％以下乙醇或丙酮中溶解；在90％以上乙醇或80％以上丙酮中难溶；在乙醚中不溶；在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。胰岛素具有蛋白质的各种特殊反应。以猪（或牛）的胰脏为原料，根据胰岛素易与锌离子结合的性质，用氯化锌作沉析剂，可使胰岛素直接从初步除去碱性和酸性杂蛋白的提取液中沉淀析出。为减少含锌量，进行两次氯化钠盐析。三、材料用具（一）材料板书讲解分组准备黑龙江生物

3、科技职业学院教案（第页）教学内容与设：冻胰脏（新鲜的牛（或猪）的胰脏在保持其腺体组织情况下用液氮或干冰速冻）（二）试剂图-4锌盐沉析法提取胰岛素操作流程脱脂盐析丙酮、锌沉析结晶干燥胰脏预处理提取碱化、锌沉析16％、27％氯化钠溶液，2％、10％柠檬酸溶液，12mol／L硫酸及浓硫酸，6mol／L盐酸及浓盐酸，65％、82％乙醇（W/W），4mol／L氨水、浓氨水，氯化锌，丙酮，硅藻土，五氧化二磷,20％醋酸锌，尼龙布（或纱布）（三）器具离心机、烧杯、布氏漏斗（8cm）、抽滤瓶（500ml）分液漏斗

4、量筒、酸度计、水浴锅、滤纸、搅拌机、不锈钢锅、搪瓷桶。四、实验方法（一）流程见图4（二）操作1．预处理将冻胰脏块用刨胰机刨碎成片，备用。2.提取将冻胰片100g置于不锈钢锅中，加入300mL82％乙醇（W/W），在10～13℃加入12mol／L硫酸，调节pH2.8～3.0，搅拌提取40min。加入6mol／L盐酸调pH至2.0，继续搅拌提取2.5h，离心（3000r/min）15min，残渣加入65％乙醇150mL，用6mol／L盐酸调pH至2.0，10～13℃搅拌提取分组操作黑龙江生物科技职业学

5、院教案（第页）教学内容与设计：2h，离心（3000r/min）15min分离残渣。合并两次提取液。3.碱化将提取液置于搪瓷桶中，然后冷至0～5℃，用浓氨水调pH7.8～8.0，加入硅藻土（每100g胰脏加6g），抽滤，滤液随即用混合酸（盐酸4mL、硫酸1mL、水4mL）酸化至pH2.5，待沉淀完全后虹吸清液，用尼龙布（或纱布）过滤，弃去沉淀，温度控制在0～3℃。4.锌沉析将碱化液置于不锈钢锅中，然后在搅拌的条件下加入氯化锌溶液（每100g胰脏加3g氯化锌，先配成30％～50％溶液，用6mol／L盐

6、酸调至pH2.5后加入），温度2～4℃，待沉淀完全后，虹吸上清液，用尼龙布（或纱布）过滤除去沉淀，清液用液氨水调pH至6.8～7.0，于5℃过夜。5.脱脂虹吸除去清液，沉淀过滤收集，溶于5倍量蒸馏水，用6mol／L盐酸调pH2.7～2.8，12～15℃放置。次日放出下层清液（上层脂肪再用5倍量蒸馏水洗涤，回收下层清液，作下批锌沉淀溶解用）。6.盐析将清液置于搪瓷桶中，在搅拌的条件下用6mol／L盐酸调pH至2.5，在温度25℃加27％氯化钠盐析。所得第一次盐析物溶于20倍量蒸馏水中，用6mol／L

7、盐酸调pH至2.5，再加入16％氯化钠盐析，过滤，收集第二次盐析物。7.丙酮、锌沉析将盐析物置于搪瓷桶中，然后在搅拌的条件下加入7倍量水、3倍量丙酮，用4mol／L氨水调pH至4.5，冷至0～5℃过夜，除去沉淀（沉淀另行回收），清液用4mol／L氨水调pH至6.0，加入20％醋酸锌（按每100g投料加入0.03mL），析出白色沉淀。8.结晶干燥过滤收集沉淀，按下列配方结晶（按每100g投料所得沉淀物计）：2％柠檬酸0.5mL，20％醋酸锌0.0065mL，丙酮0.16mL，蒸馏水稀释至1mL。结晶

8、液冷却至0～5℃，用4mol／L氨水碱化至pH8.O，过滤除去沉淀。用10％柠檬酸调至pH6.0，搅拌结晶两天，虹吸除去清液，离心，收集结晶，用蒸馏水洗2次，丙酮洗2次，以五氧化二磷真空干燥，得成品。黑龙江生物科技职业学院教案（第页）案教学内容与设计：五、注意事项1.采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断。要立即深冻，–15℃保存备用。如用液氮或干冰速冻，效果更好。在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高收率10％。2.胰岛素对高能辐射非常敏感，容易失活；紫外线能破坏