梯度离心知识讲解.ppt

《梯度离心知识讲解.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、梯度离心目的要求了解密度梯度离心分离原理，了解DNA粗提方法。掌握密度梯度离心制作过程及方法。原理在较大的离心力作用下，不同的DNA由于其大小、形状和密度不同，而悬浮在不同密度的位置上，从而达到分离。核酸分子中的碱基含有共轭双键，具有一定的紫外吸收特性，其最大吸收峰的波长为260nm。在波长为260nm，光程为1cm，A260＝1时，相当于双链DNA浓度为50μg/mL，单链DNA为40μg/mL。紫外分光光度法可用于测定浓度大于0.25μg/mL的核酸浓度。DNA浓度计算公式：C（μg/mL）＝40μg/mL×1/光程×A260×稀

2、释倍数。材料用具新鲜的鸡肝生理盐水（冷）、5%十二烷基磺酸钠溶液、45%乙醇、95%乙醇（冷）、乙醇（冷）、丙酮（冷）、氯化钠粉末、5%、10%、20%、30%蔗糖溶液（5%蔗糖溶液配制：称取蔗糖5g溶于100mL蒸馏水液中，加5g活性炭，于沸水浴中加热25min，过滤取清液）离心机、灭菌离心管（10mL）、烧杯（1L）、大三角瓶、天平、量筒、匀浆机、1.0mL注射器、超速离心机、No.22针头、紫外分光光度计等。蔗糖密度梯度溶液的制备将5%、10%、20%、30%蔗糖溶液各10mL，按浓度依次减小的顺序逐个铺入离心管中即制成不连续阶

3、梯密度梯度。此离心管于20-25℃静置2--3h，通过重力作用即成接近线性的连续密度梯度液。若用细铁丝轻敲离心管，静置时间可以缩短至0.5～1h。温度低时所需静置时间较长，温度高时则较短。为减少对流，静置后应将离心管置冰浴中备用。DNA样品制备（1）组织破碎：取一定量的新鲜的鸡肝，加4倍量生理盐水，经组织捣碎机捣碎lmin，匀浆，2500r/min离心30min,沉淀用同样体积生理盐水洗涤3次，每次洗涤后离心，将沉淀物悬浮于20倍量的冷生理盐水中，再捣碎3min。（2）除杂蛋白：上述组织液中加入2倍量5％的十二烷基磺酸钠，用45％乙醇

4、作溶剂，搅拌20～30min,在0℃，2500r/min离心，收集上清液并加入等体积的冷95％乙醇，离心即可得到纤维状DNA。DNA样品制备（3）精制：将粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％的十二烷基磺酸钠，用1/10体积45％乙醇作溶剂，搅拌0.5h,经5000r/min离心15min，上清液中加入NaCl至终浓度1mol/L，再缓慢加入冷95％乙醇，DNA析出。（4）样品制备：取上述DNA溶于适量蒸馏水中，用紫外分光光度计测其含量。备用。梯度离心（1）在每个离心管内的梯度溶液表面，分别加入1.0mLDNA样品溶液。加样时，用注射器吸

5、入样品，在梯度溶液表面上方0.5mm左右，沿管壁慢慢加入。不允许自由滴落，也不允许针头接触梯度液面。（2）装好样品后，小心拧紧离心管帽，装好套筒、转头，按使用程序启动超速离心机，在0℃以25000r/min离心分离1～3h。梯度溶液的分部收集离心后，取出离心管，置于冷室中。用No.22针头将聚乙烯离心管底部正中位置穿刺，梯度溶液慢慢流出。用小试管将流出的梯度溶液分部收集，每管25滴。DNA浓度测定用适量双蒸水稀释收集的样品，用紫外分光光度计测定各管DNA样品的A260，根据公式计算DNA浓度。C（μg/mL）＝40μg/mL×1/光程

6、×A260×稀释倍数。注意事项1、注意操作温度。2、组织捣碎机捣碎的时间不可过长。思考题为什么所用离心管等器皿必须灭菌？蔗糖密度梯度在离心中起什么作用？此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢