密度梯度离心基础

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1、密度梯度离心基础一、概论在密度梯度离心中，单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。梯度液的密度随着离心半径的增大而增加。密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，密度梯度可以分为：速率—区带（Rate-Zonal）离心和等密度（Isopycnic）离心。在速率—区带离心中混合样品以很薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于不同组份“颗粒”在梯度液中沉降速率的差别，而在离心的某一时刻形成了数个含有单一组份颗粒的“区带”。离心过程中在最“重”的样品（或者说沉降得最快的样品）形成沉淀前就停止了。样品在离心后与梯度液一起收集，用常规技术去除梯

2、度材料后就得了某个较纯的成份。每个单一组份的沉降速率取决于它们的形状、尺寸、密度、离心力的大小、梯度液的密度和粘性系数。对于相类似的生物体组份常常形状也相似。在速率—区带离心中我们常常使梯度液的最大密度不超过在该梯度中的浮密度。利用这类生物体组份在尺寸上的差异而形成的沉降速率的不同，选择某一特定时刻，当它们中的各个纯样品区带之间的距离拉得最远时停止离心即可以达到分离目的。与速率—区带离心法不同的是，等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至和梯度液混在一起。最后一种方法依靠离心力来形成梯度（自形成梯度）在

3、形成梯度的过程中由于样品各单一成份向它们自己的等密度区靠拢即达到了分离纯化的目的。对于速率—区带离心，梯度液最大密度一般小于样品中各组份的密度，也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉淀后来分离样品；而等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。密度梯度离心法的理论基础是（参考文献1）每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为：式中：v是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒）        d：样品颗粒的直径（厘米），我们在初步计算时就假设样品颗粒为球体。非球形颗粒样品，可以以上式为基础

4、进行修正。        σ：样品颗粒的密度（克/厘米3）        ρ：密度梯度液的密度（克/厘米3）        η：密度梯度液的粘性系数（克/厘米•秒）        ω：离心机主轴的旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：转/分        r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）当：σ>ρ时，v>0即样品顺离心力方向沉降     σ<ρ时，v<0即样品逆离心力方向上浮     σ=ρ时，v=0即样品停止沉降或上浮，“稳定”在这一位置用这个公式可以很好地解释在速率—区带离心法或等密度离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。二、转头的选择

5、：1、离心转头分类：转头类别使用的离心机发明时间、发明者或推广商固定角式转头低、高、超速1943年，（英）Pickels甩平转头低、高、超速1951年，（德）Kahler垂直管转头高、超速1974~1975年，（美）Dupont公司区带转头低、高、超速1964~1965年（英）Anderson近垂直管转头超速1989年，（日）HitachiKoki（美）Beckman公司连续离心转头低、高、超速1965年，（英）MSE公司其他特种转头：分析转头、土壤脱水转头、细胞浮选转头、管式转头、血球比测定转头、细胞淘洗转头等等。 2、各种转头用于密度梯度离心的比较：（1）各种转头用

6、于速率—区带（R-Z）离心的优缺点分析：A、固定角式转头：壁部效应影响很大，用于R-Z离心回收率低，纯度也受影响一般只用于差分离心和等密度离心，离心时间较短。是各类离心机的最高速转头。B、甩平转头：细长离心管用于R-Z离心可以获得较高纯度和高分辨率，且容易控制离心时间，壁部效应很小。25,000rpm~30,000rpm的甩平转头最适用于亚细胞器的离心分离，而40,000~42,000rpm的甩平转头适用于核酸、蛋白、病毒等类物质的分离。离心时间较长。C、垂直管转头：沉降距离最短，因而离心分离时间也最短。最大半径前几乎没有壁部放位，最大半径后有一定壁部效位，垂直剖面积较

7、大，因而离心后纯样品区带的容量也较大。但在有沉淀的密度梯度离心中，沉淀和浮动区带方向转换之间存在干扰，可能影响纯样品区带的纯度。大部分R-Z离心没有沉淀，垂直管转头很适合做R-Z离心。D、近垂直转头：管轴线与旋转主轴之间倾角7度~9度（角式转头20度~45度）沉降距离比垂直转头稍大，离心时间比角式、甩平转头都要短。由于有了倾角，沉淀可沿管壁滑向底部，因此基本上消除了沉淀与浮动区带转换之间的干扰，适合做R-Z离心，特别适合做生物大分子（如质粒DNA）的自形成梯度等密度离心。E、区带转头：没有壁部效应特别适合做大容量的病毒、亚细胞器、生物大分