李丽娜开题完稿描述教学文稿.ppt

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1、李丽娜开题完稿描述1.枯草芽孢杆菌研究意义食品学院2009级研究生开题报告2.全基因组改组研究的意义一.研究的目的和意义生长快、营养简单，能产生耐热抗逆的芽抱，这也有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。全基因组改组是近年来兴起的微生物遗传育种和菌种改良的一项新技术。该项技术通过微生物多个正突变体递进融合进行基因组随机重组，快速筛选所需表型有重大改进的菌株。二.国内外研究动态和趋势1.国内研究概况2.国外研究概况200

2、7年胡雪萍等在比较纳豆芽孢杆菌营养体和芽孢之间的生物学特性时发现,芽孢对温度、酸碱度、盐和模拟胃肠道环境等不利环境的耐受性均明显强于营养体,可在模拟胃肠道环境中生长萌发。日本学者用NTG诱变处理链霉菌U121的孢子,获得突变菌株的基因组库,然后通过三轮的基因组改组,获得的菌株产HCA能力比原始出发菌株产量高5倍以上,三角瓶培养显示细胞生长速度也获得了大幅提高。食品学院2009级研究生开题报告三．试验研究的主要内容和方法主要内容食品学院2009级研究生开题报告1、枯草芽孢杆菌生长条件的确定。2、菌株产酶活性的测定。3

3、、菌株紫外线诱变，选育高产酶菌株。4、菌株全基因组改组技术的研究。三．试验研究的主要内容和方法食品学院2009级研究生开题报告3.1枯草芽孢杆菌生长条件的研究种子液制备250mL锥形瓶分装50mL基础LB种子培养基接种后，在37℃，160rpm的条件下震荡培养12h。以灭菌的基础种子培养基作为空白对照，测定菌液的OD600，作为培养条件优化的种子液。菌种生长培养液配制及测定将种龄为12h的种子培养液按5%接种于装有6mL基础种子培养基的试管中。已接种的试管分别在各单因素条件下振荡培养，每隔两小时取样，测定OD600

4、，达到菌种的最大生长量为止。以时间为横坐标，以OD600为纵坐标，绘制菌种生长曲线，使菌种在短时间内达到较大生长量者为最适生长条件。Title吸水率温度pH摇床转速接种量装液量种龄实验方法食品学院2009级研究生开题报告食品学院2009级研究生开题报告实验方法3.2菌种产酶活性测定3.2.1蛋白酶活性测定3.2.2淀粉酶活性测定3.2.3纤维素酶活性测定3.2.4脂肪酶活性测定食品学院2009级研究生开题报告实验方法3.3紫外线诱变出发菌株斜面→洗下孢子→过滤除菌丝→制成孢子悬浮液→紫外线诱变→转无菌管0℃2h→后

5、培养→稀释涂平板→暗培养24h→初筛→复筛→高产酶菌株→生化鉴定→遗传稳定性食品学院2009级研究生开题报告实验方法3.3紫外线诱变1.紫外灯照射时间对诱变的影响时间(s)2030405060708090100110对照菌落个数2.筛选步骤UV第一轮：一株出发菌株→选出200株单菌落→初筛→选出60株→复筛→选出五株UV第二轮：五株出发菌株→5×40株→初筛→选出60株→复筛→选出五株第三、四轮……同第一轮直至选出较优菌株食品学院2009级研究生开题报告实验方法3.4全基因组改组技术出发菌株斜面→洗下孢子→过滤处菌

6、丝→制成孢子悬浮液→预处理→酶解→稀释涂平板→初筛→复筛→高产酶菌株→生化鉴定→遗传稳定性3.4.1原生质体制备24℃26℃28℃30℃32℃34℃36℃生成率再生率1%2%3%4%5%6%7%生成率再生率6h6.5h7h7.5h8h8.5h9h生成率再生率食品学院2009级研究生开题报告3.4.1原生质体制备实验方法1.酶解温度对原生质体制备的影响2.酶浓度对原生质体制备的影响3.酶解时间对原生质体制备的影响4.正交实验确定原生质体制备的最佳条件（A）温度℃（B）时间h（C）浓度%实验1实验2实验3实验4实验5实

7、验6实验7实验8实验9111222333123231312123312231食品学院2009级研究生开题报告实验方法3.4.2原生质体融合取两亲株原生质体悬浮液各lml混合，3500r/min离心15分钟。弃去上清液，缓慢加入预热1.8ml10%PEG6000溶液和0.2ml的新生磷酸钙溶液，融合30min，混合均匀.立即加入SMM终止反应，3500r/min离心10min去除融合液，SMM高渗缓冲液离心洗涤两次后，重悬于SMM液中，用SMM高渗透压缓冲液稀释10倍后，取0.1ml用夹层法培养于再生基本培养块平板上

8、，培养7天观察记数取单亲株及混合后不加PEG的原生质体分别作对照试验。3.3.4.1融合子的检出将PEG处理好的原生质体作适当稀释，先涂布在再生平板上，使亲株及重组子都生长出菌落，然后用影印法复制到含抗性的培养基上，此后长出的菌落即为融合株。3.3.4.2融合子的鉴定稳定性鉴定菌落特征比较融合子与亲本菌株的拮抗试验酶活性的测定实验方法3.3.4融合子的检出及