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时间:2017-12-29
《nmda受体nr2b亚型基因对海马成年新生神经元形态发生的影响》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、NMDA受体NR2B亚型基因对海马成年新生神经元形态发生的影响摘要:目的研究NMDA受体NR2B亚型基因对海马成年新生颗粒细胞形态发生的影响。方法通过Creloxp重组酶系统构建NMDA受体NR2B亚型基因单细胞敲除模型。运用Neurolucida软件系统对野生型、NR2B基因敲除成年新生神经元进行形态重建,观察树突长度、树突复杂度以及棘突的变化。结果NR2B基因敲除成年新生神经元外形与WT神经元相似,树突长度接近,棘突减少。Sholl分析显示在以胞体为中心,距胞体不同距离的树突亚区域内,树突复杂性(树突交叉)减低,与此同时棘突分布密度减低(P<0.05)。结论
2、海马成年新生颗粒神经元NR2B基因敲除对新生细胞树突长度影响甚微,但降低了树突复杂性,减少棘突形成,从而导致了功能性整合入海马特定神经信息网络的障碍。 关键词:成年神经发生;NMDA受体;NR2B亚型;形态发生 中图分类号:R392文献标识码:A文章编号:16721349(2012)12149503 成年神经发生(adultneurogenesis)在哺乳动物前脑持续存在,脑卒中、癫痫、创伤、环境刺激、情绪等因素均会影响成年后神经发生。行为学证据表明[1,2],海马成年神经发生对于海马某些形式的学习、记忆以及情绪调节非常重要。成年新生神经元,具有长时程增强
3、(longtermpotention,LTP)、动作电位诱发阈值降低、兴奋性增高等神经活性[3]。海马癫痫为神经兴奋性增加的最常见的形式之一,也可以诱发增加成年神经发生:在红藻氨酸注射诱发的癫痫模型[4]和癫痫的点燃激发模型均能观察到神经发生增加[5]。而在匹罗卡品诱发癫痫模型中,通过阻滞成年神经发生可以减少自发性复发性癫痫的发生[6]。因此,海马神经活性与成年神经发生之间存在着紧密的双向联系。 而NMDA受体依赖型的长时程增强是成年神经发生中神经活性、突触可塑性的重要证据,被认为是海马空间记忆的神经生物机制[7,8]。Ge等[3]研究发现,LTP是依赖于NM
4、DA受体NR2B亚型基因的。因此,研究NMDA受体NR2B亚型基因对海马成年新生神经元发育成熟过程的影响,对于进一步探讨新生神经元的功能、神经活性、海马依赖的学习和记忆分子机制,以及未来可能的治疗策略,均具有非常重要意义。 本研究建立海马成年新生神经元NR2B基因敲除模型,观察NR2B基因敲除对成年新生神经元细胞形态、树突、棘突发育等的影响,进一步阐明NR2B基因在海马成年发生中的重要作用。 1材料与方法 1.1实验动物与分组经基因型鉴定后的清洁级成年健康NR2Bfl/fl转基因小鼠[9](NR2B基因被loxp序列标记),C57BL/6野生型小鼠(wil
5、dtype,WT),同济医学院实验动物中心提供,体重20g~30g。NR2Bfl/fl转基因小鼠为实验组,C57BL/6小鼠为WT对照组。 1.2实验方法 1.2.1海马成年新生神经元NR2B基因敲除模型制作运用逆转录病毒基因标记技术,利用Creloxp重组酶体系,建立海马成年新生神经元单细胞NR2B基因敲除模型。本实验采用的是逆转录病毒载体MoloneyRSVpGFP:T2aCre(Dr.WolfgangKelsch馈赠):带有一个来源于Roussarcomavirus内源性启动子RSV;pGFP与Cre基因由T2a序列连接,T2a序列保证了GFP基因与C
6、re基因的同时高效率表达[10]。 当逆转录病毒注射入成年神经发生部位时(海马齿状回颗粒下层),感染带有loxp打靶基因NR2B的神经祖细胞/母细胞,当Cre酶激活时,Creloxp重组酶系统工作从而产生海马新生单细胞NR2B基因敲除模型。当Cre在NR2Bfl/fl转基因小鼠海马齿状回表达后,GFP+阳性神经元为NR2B基因敲除海马新生神经元(ΔNR2B神经元)。野生型小鼠作为对照。 1.2.2小鼠海马齿状回立体定位注射Isofluran(Baxter)吸入麻醉(0.5mL/100g),固定小鼠于立体定位仪上(Kopf921,德国)。麻醉以及手术期间用加热
7、毯持续加热,保持体温37℃~37.5℃。根据海马齿状回立体坐标定位(前囟向后2mm,旁开1.3mm,深1.8mm),用牙科钻钻孔,在双侧海马各注射1mL病毒(RSVpalmGFP:T2aCre)。 1.2.3组织漂片制作和免疫组织化学染色在逆转录病毒注射后17d予以经心脏4%多聚甲醛灌注取脑。组织漂片(150μm)于3%H2O2室温处理20min~25min。2%TritonX100室温破膜1h。5%BAS+0.2%TritonX100室温封闭1h。1抗工作液4度孵育24h(兔抗EGFP1∶1000,Invitrogen)。生物素标记的抗兔二抗(1∶500,V
8、ectorLaborat
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