双向电泳培训课程ppt课件.ppt

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1、Bio-RadChina王丙力2006-08北京双向电泳培训主要内容双向电泳培训实验内容1.样品制备及试剂准备2.第一向等电聚焦原理及操作3.第二向SDS-PAGE实验前准备—试剂配制及制胶4.第一向等电聚焦后胶条的处理---平衡及转移5.第二向SDS-PAGE原理及操作6.染色及成像培训师的作用时间管理时间安排三天（以2人计算、两块7cm小胶）在客户处培训,可根据实际情况调整第一天下午2：00—3：30实验原理及操作注意事项3：30—5：00双向电泳第一向操作示范第二天上午9：00—11：30第二向准备工作及部分仪器演示第二天下午1：00—5：00

2、转移及第二向电泳，凝胶染色双向电泳培训前期准备工作内容1.培训使用主要仪器双向电泳培训前期准备工作内容2.培训使用主要耗材启动试剂盒启动试剂盒双向电泳培训实验内容一.样品制备及试剂准备1.从冰箱中取出4℃保存的双向电泳启动试剂盒。2.在上样缓冲液干粉瓶中加入6.1ml去离子水，使之溶解。3.吸取2ml溶解后缓冲液，加入到E.coli蛋白样品瓶中，制成浓度为1.35mg/ml的蛋白质样品。样品制备所需试剂双向电泳培训实验内容二.第一向等电聚焦原理及操作1.原理在第一向分离中蛋白质先按其等电点（isoelectricpointpI值）分开。pI值就是使蛋

3、白质不带净电荷，且在电场中不发生迁移的特定pH值。这项将蛋白质按其等电点分离的技术称为等电聚焦（IEF）。CarboxylicGroupsAcidicpHR-COO-+H+=>R-COOHBasicpHR-COOH+OH-=>R-COO-+H2OAminoGroupsAcidicpHR-NH2+H+=>R-NH3+BasicpHR-NH3++OH-=>R-NH2+H2OIsoelectricFocusing原理等电点（isoelectricpoint）:在某一pH时，蛋白质的净电荷为零。蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象+–pH3pH7.5pH

4、10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10The1stD:IsoelectricFocusing双向电泳培训实验内容二.第一向等电聚焦原理及操作2.操作-----双向电泳上样A.沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。B.胶条长度加样体积样品蛋白量7cm:125ul(169ug),11cm:185ul(250ug),17cm:300ul(405ug)-----考马氏亮蓝R-250染色C.取出-

5、20℃冷冻保存的IPG预制胶条（7cmpH4-7），室温中放置10分钟。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。D．将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产生气泡。第一向等电聚焦电泳仪开机界面开机界面双向电泳上样水化上样操作二.第一向等电聚焦原理及操作2.操作-----双向电泳上样E.在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶条长度,本实验1.5ml)，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。F.对好正、负极，盖上盖子。将

6、聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。将样品置于IEF仪器内二.第一向等电聚焦原理及操作等电聚焦程序7cm胶条水化12小时（18℃）主动水化（50V）或被动水化S1250V线性30分钟除盐S2500V快速30分钟除盐S34000V线性3小时升压S44000V快速20,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持二.第一向等电聚焦原理及操作等电聚焦程序11cm胶条水化12小时（20℃）主动水化（50V）或被动水化S1250V线性30分钟除盐S21000V快速30分钟除盐S38000V线性4小时升压S48000V快速40,000伏小时聚焦S550

7、0V快速任意时间保持二.第一向等电聚焦原理及操作等电聚焦程序17cm胶条水化12小时（20℃）主动水化（50V）或被动水化S1250V线性30分钟除盐S21000V快速1小时除盐S310000V线性5小时升压S410000V快速60,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持双向电泳培训实验内容3.第二向SDS-PAGE实验前准备—试剂配制及制胶A.试剂准备161-015730%Acrylamide/BisSolution,29:1,2×500ml预混合制胶液161-0700AmmoniumPersulfate,10g161-0801TEMED,5

8、0ml161-0700AmmoniumPersulfate,10g161-0798Resolvinggelb