基因表达检测ppt课件.ppt

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1、第三部分：基因表达检测基因表达检测的应用范畴检测自然变异等位基因的表达差异；检测突变体基因功能的丧失或获得；检测转基因的表达：OX&抑制&突变。基因表达检测的技术手段RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)Real-timePCR=qRT-PCRNorthernBlottingRT-PCR(qRT-PCR)RNA抽提cDNA反转录基因特异性引导Oligo(dT)引导随机六核苷酸引物引导PCRNorthernBlotting基因表达分析的一般流程NorthernBlottingInventedbyKa

2、ryMullisin1983andAwardedNobelPrizeforChemistryin1993基因表达水平mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR；RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。实验原理总RNA提取RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和cDNA的合成都是必须的；RNA的纯度和完整性对于Northernblot,RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要；RNA分离的

3、方法很多，最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染。被污染的试剂，缓冲液移液器使用的器皿及tip等操作者的手、口、头发等RNA操作中应注意的关键问题：防止RNase污染外源RNase的主要来源：处理并专用：移液器、玻璃器皿、离心管、枪头、溶液、缓冲液、RNA电泳装置用0.1％的DEPC在37ºC处理溶液1小时后，有的再高压蒸气灭菌15min，烘干备用；180－300ºC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品；也可使用新的、无RNA酶的一次性tubes,tips等；在分离RNA的过程中用RNA酶抑

4、制剂以抑制RNA酶的活性。防止外源RNase污染的主要措施材料要新鲜、取样离体时间要短并快速冷冻；裂解过程要同RNase活性抑制同步：快速冷冻。防止内源RNA酶降解RNARNA酶抑制剂RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有：DEPC（焦碳酸二乙酯）：形成组胺基团破坏RNase的活性；氧钒核糖核苷复合物：能与多种RNA酶活性位点结合RNA酶；蛋白质抑制剂：可与RNase形成非共价的复合物。实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳

5、带评价RNA质量实验材料：水稻幼嫩叶片苯酚/氯仿反复抽提，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可配合氯化铯离心或有机溶剂提取。TrizolReagent提取方法利用Trizol试剂抽提植物总RNA原理Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA;用这种方法得到的总RNA中

6、蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern，RT-PCR，分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。75％乙醇（inDEPC-treatedwater)氯仿、异丙醇（RNA专用）RNase-freewater：DrawwatertoRNase-freeglassbottles.Adddiethylpyrocarbonate（DEPC）to0.1%.Letstandovernightandautoclave.防止外源RNase的污染：应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180ºC烘烤3hrs以上；一次性用品如tube、ti

7、p、塑料制品等使用DEPC蛋白质变性剂处理，或者用新的、无RNA酶的产品；电泳槽相关的用0.4M的NaOH处理，再用DEPC水洗3遍。RNA抽提前应准备的其它试剂及物品操作步骤液氮取样，液氮磨样，每管分装0.1克样品；每管加1mlTrizol试剂（样品体积不超过Trizol试剂体积的10％），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置5－10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离；加200µl的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右；2-8℃，12000g离心10-15分钟；将水相（上清）转入一新离心管

8、，加0.5ml异丙醇室温下沉淀10分钟（或加入2倍体积无水乙醇-20℃放置2h以上）；3.2-8℃，12000g离心15分钟，弃上清，加1ml75％乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500g离心5’，小心弃上清；室温静置15分钟，使RNA沉淀恰好干燥，加入20µlDEPC水于65℃水