3 基因表达检测_ppt课件

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1、第三部分：基因表达检测基因表达检测的应用范畴检测自然变异等位基因的表达差异；检测突变体基因功能的丧失或获得；检测转基因的表达：OX&抑制&突变。基因表达检测的技术手段RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)Real-timePCR=qRT-PCRNorthernBlottingRT-PCR(qRT-PCR)RNA抽提cDNA反转录基因特异性引导Oligo(dT)引导随机六核苷酸引物引导PCRNorthernBlotting基因表达分析的一般流程NorthernBlottingInventedbyKaryMullis

2、in1983andAwardedNobelPrizeforChemistryin1993基因表达水平mRNA反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR；RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。实验原理总RNA提取RNA的制备与分析对于了解基因在转录水平上的调节和cDNA的合成都是必须的；RNA的纯度和完整性对于Northernblot,RT-PCR和cDNA文库的构建等分子生物学实验都至关重要；RNA分离的方法很多，最关键的因素是尽量减少

3、RNA酶的污染。RNA酶抑制剂RNA酶是一种很顽固的酶，在RNA分离和鉴定的各个阶段严重威胁RNA的完整性。用来使RNA酶不发挥作用的RNA酶抑制剂主要有：DEPC（焦碳酸二乙酯）：形成组胺基团破坏RNase的活性；氧钒核糖核苷复合物：能与多种RNA酶活性位点结合RNA酶；蛋白质抑制剂：可与RNase形成非共价的复合物。实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳带评价RNA质量实验材料：水稻幼嫩叶片苯酚/氯仿反复抽提，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，

4、可配合氯化铯离心或有机溶剂提取。TrizolReagent提取方法利用Trizol试剂抽提植物总RNA原理Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA;用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern，RT-PCR，分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。75％乙醇（inDEPC-treatedwater)氯仿、异丙醇（RNA专用）RNa

5、se-freewater：DrawwatertoRNase-freeglassbottles.Adddiethylpyrocarbonate（DEPC）to0.1%.Letstandovernightandautoclave.防止外源RNase的污染：应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180ºC烘烤3hrs以上；一次性用品如tube、tip、塑料制品等使用DEPC蛋白质变性剂处理，或者用新的、无RNA酶的产品；电泳槽相关的用0.4M的NaOH处理，再用DEPC水洗3遍。RNA抽提前应准备的其它试剂及物品操作步骤液氮取样，液氮磨样，每管分

6、装0.1克样品；每管加1mlTrizol试剂（样品体积不超过Trizol试剂体积的10％），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置5－10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离；加200µl的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右；2-8℃，12000g离心10-15分钟；将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml异丙醇室温下沉淀10分钟（或加入2倍体积无水乙醇-20℃放置2h以上）；3.2-8℃，12000g离心15分钟，弃上清，加1ml75％乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），75

7、00g离心5’，小心弃上清；室温静置15分钟，使RNA沉淀恰好干燥，加入20µlDEPC水于65℃水浴溶解10分钟，保存于-70℃；取2µl琼脂糖电泳检测RNA质量。RNA的琼脂糖凝胶电泳进行质量检测用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进行琼脂糖凝胶电泳用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在含6％或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳检测0.5×TBE电泳：1×MOPS（3-(N-吗啉基）丙磺酸）80—150V40min—1h有溴化乙锭存在时，电泳后28SrRNA和18SrRNA在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由tRNA，5

8、.8SrRNA和5SrRNA组成的较模糊的迁移较快的带。如果RNA没有降解，28SrRNA的亮度应当是18SrRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。WhatdoesgoodorbadtotalRNAloo