紫外分光光度计的使用原理和方法

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1、第三章紫外-可见分光光度法紫外-可见吸收光谱朗伯-比耳定律紫外-可见分光光度计分析条件的选择测定方法在医学检验中的应用紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visiblespectrophotometry,UV-VIS)按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析,所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。紫外-可见分光光度法的特点：1与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和操作都比

2、较简单，费用少，分析速度快;2灵敏度高;3选择性好;4精密度和准确度较高;5用途广泛。§1.紫外-可见吸收光谱1.物质对光的选择性吸收物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础。通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。如图3-1；在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。2有机化合物的紫外-可见吸收光谱与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的σ电子、形成双键的π电子以及未参与成键的n电

3、子。跃迁类型有：σσ*、nσ*、ππ*、nπ*四种。2.1有机化合物的电子跃迁饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*，n→σ*跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π*跃迁，吸收峰一般大于200nm。生色团：是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。见表3-1和3-2。助色团：是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当

4、它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸收强度。见表3-4。红移和紫移在有机化合物中，常常因取代基的变更或溶剂的改变，使其吸收带的最大吸收波长λmax发生移动。向长波方向移动称为红移(表3-3)，向短波方向移动称为紫移。2.2有机化合物的吸收带吸收带(absorptionband):在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。R吸收带K吸收带B吸收带E吸收带3无机化合物的紫外-可见吸收光谱镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的吸收是基于内层f电子的跃迁而产生的。其紫外可见光谱为

5、一些狭长的特征吸收峰，这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影响。1.f电子跃迁吸收光谱过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰强烈受配位环境的影响。例如cu2+以水为配位体，吸收峰在794nm处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。此类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。2.d电子跃迁吸收光谱3.电荷迁移光谱某些分子既是电子给体，又是电子受体，当电子受辐射能激发从给体外层轨道向受体跃迁时，就会产生较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。如苯酰基取代物在光作用下的异构反应。1.4影响紫外-可见吸收光谱的因素物质的吸

6、收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。1.温度在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。2.溶剂注意如下几点：（1）尽量选用低极性溶剂；（2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；（3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。3.pH值1.5紫外-可见吸收光谱的应用紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。1.定性分析2.纯度的鉴定用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。如蛋白质与核酸的纯

7、度分析中，可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。3.结构分析紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。§2.朗伯-比尔定律设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透射光强度为It，反射光强度为Ir，则I0=Ia+It+Ir由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，上式可简化为：I0=Ia+It一、吸光度和透光度吸光度:为透光度倒数的对数，用A表示，即A=lg1/T=lgI0/It透光度：透光度为透过光的强度It

8、与入射光强度I0之比，用T表示：即T=It/I0二、朗伯-比尔定律朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光