结果影响因素ppt课件.ppt

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1、ELISA测定结果影响因素2021/9/8主要内容一、ELISA简介二、ELISA试验结果影响因素ELISA简介ELISA( EnzymeLinked Immunosorbnent Assay )是酶联接免疫吸附测定的简称。是一种免疫学测定方法，主要通过抗原抗体反应检测液体标本中目的蛋白性质、功能及含量。ELISA实验原理抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性并能相互特异性结合。抗原抗体复合物与酶标二抗结合，加入合适的底物，在酶的作用下显色，颜色深浅与特异性抗体成比例关系，可进行定性和定量分析。抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反

2、应的专一性ELISA检测方法主要操作流程+已知抗体包被于载体表面加待检物无抗原与抗体结合洗涤洗涤洗涤洗涤-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY已知抗体包被于载体表面加待检物抗原与抗体结合加酶标抗体与抗原结合加酶作用的底物产生颜色加酶标抗体与抗原结合加酶作用的底物不产生颜色双抗体夹心法测抗原ELISA结果判定1.定性测定(1)肉眼观察：比较检测孔与对照孔的颜色。(2)阳性判定值法(cut-offvalue，CO值)：一般为阴性对照的平均A值加一个常数，标本A值≥CO值即为阳性。(3)抑制率法：在竞争抑制法中结

3、果可用抑制率表示。抑制率(％)＝(阴性对照A-待测A)／阴性对照AX100％,一般以抑制率≥50％为阳性2.半定量测定结果一般以滴度表示。将标本连续稀释后，进行ELISA检测，在阳性临界值以上的最高稀释度即为该标本的“滴度”。3.定量测定用己知量的标准品作一系列稀释后进行ELISA测定，与待测标本同时进行测定，绘制标准曲线，结果以绝对量或活性单位表示。ELISA结果判定结果判定方法的选择：结果影响因素ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时会出现一些错误结果。引起错误

4、结果的原因主要有：1、标本因素2、试剂因素3、操作因素4、环境因素。结果影响因素——标本因素内源性物质类风湿因子补体嗜异性抗体自身抗体医源性诱导的抗体交叉反应物外源性物质标本溶血标本污染贮存过久凝集不全采血管中添加物标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种。结果影响因素——标本因素内源性物质：（1）类风湿因子与ELISA系统中的捕捉抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，导致假阳性结果。解决办法是：①用F(ab)2替代完整的IgG；②标本用联有热变性（63℃，10 min）IgG的固相吸附剂处理（将热变性IgG加入到标本

5、稀释液中同样有效）；③检测抗原时，可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中，使RF降解。（2）补体ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程中，抗体分子发生变构，其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来，使C1q可以将二者连接起来，从而造成假阳性。解决的办法是：①用EDTA稀释标本；②用53℃，10 min或56℃，30 min加热血清使C1q灭活。（3）嗜异性抗体人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ig  (s)结合的天然嗜异性抗体，可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。解决办法是：可在标本稀释液中加入过量的动物Ig  (s)，但加入量

6、不足或亚类不同时无效。结果影响因素——标本因素（4）嗜靶抗原的自身抗体抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。解决的办法：测定前用理化方法将其解离。（5）医源性诱导的抗鼠Ig ( s )抗体鼠源性CD3等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使病人体内产生抗鼠抗体；另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig ( s )抗体。这些病人ELISA测定时均可产生假阳性。解决的办法是：测定抗原时，在标本中加入足量的正常鼠Ig (

7、 s )。（6）交叉反应物质类地高辛、类AFP样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，假如交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。结果影响因素——标本因素外源性物质：（1）标本溶血红细胞溶解释放的血红蛋白具有过氧化物酶活性，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，会导致非特异性显色，故标本采集时应避免溶血。（2）标本受细菌污染菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，同溶血标本一样，可产生非特异性显色而干扰测定结果。（3）标本保存不当标本放置时间过长（一天以上

8、），会使抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。冰箱中久存的标本，血清中IgG可