细胞实验技术.docx

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1、（一）干扰引物（shRNA）设计：1、NCBI上下载基因序列2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游）3、从起始密码（ATG）下游25bp开始；4、GC含量介于40%~60%5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区6、选择脱靶率低的（二）、干扰载体构建1、引物退火（引物加水看标签X50,弹匀，瞬离）退火体系：上游：5ul下游：5ul10XMbuffer5ulH2O35ul水浴锅100℃2min，锅里隔夜（三）、酶切plko.1载体1、AgeI酶切，反应体系：plko.1载体4

2、ugAgeI2ul10XAgeIbuffer5ulH2O39ul37℃水浴2~3h2、切胶回收AgeI酶切产物，30ul水洗脱3、EcoRI酶切，反应体系：AgeI酶切产物30ulEcoRI2ul10XHbuffer5ulH2O13ul37℃水浴2~3h切胶回收，30ul水洗脱，测浓度（四）、连接连接体系：T4连接：退火引物2ul退火引物5ul酶切载体1ul酶切载体1ulSolutionI5ulT4连接酶1ulH2O2ulT4连接酶Buffer1ulH2O2ul室温下连接4h。（五）、转化-80℃取感受态细胞于冰

3、上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。（六）、挑菌用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。（七）、提质粒碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大

4、部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。1、取5ml菌液于离

5、心管，12000rpm1min，弃上清2、向沉淀加500ulP1，震荡重悬3、加入500ulP2，温和翻转6~8次，充分裂解（不超过5min，一般3min）4、加入700ulP3，温和翻转6~8次，出现白色絮状沉淀，12000rpm10min5、将上清加入CS柱（已放入收集管），12000rpm2min，将收集管中液体加入吸附柱CP4中，12000rpm，1min，弃废液6、CP4柱中加入500ulPD,12000rpm，1min，弃液7、CP4柱中加入600ulPw,室温放置3min,12000rpm，1min

6、，弃液8、空离12000rpm，2min，室温放置几分钟（把乙醇蒸发）9、CP4柱置于1.5ml离心管，向柱中心加35ulddH2O，室温放置2min，12000rpm，1min。（三）、测质粒浓度打开软件，ddH2O清洗仪器3~5次，点击black，F1，结果不大于0.2每个样品吸取1ul，于仪器上，F1，结果浓度大于500，OD值1.88~1.90质粒置于-20℃，保存（四）、细胞复苏1、37℃预热PBS，取8mlPBS于10ml离心管中2、液氮中取出冻存的细胞，37℃水浴融化3、吸取冻存细胞于PBS中，轻混

7、匀，室温800rpm3min，去上清，加入1ml培养基重悬，4、细胞重悬液加到含8ml培养基的培养皿中，37℃，5%CO2,培养（五）、细胞分盘1、吸去培养液，加入PBS清洗2、吸去PBS，加入1ml胰酶，37℃培养箱消化1min3、用巴氏吸管加入2ml培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5ml离心管中，750rpm，室温，5min4、加入1ml培养液重悬，按1；3分盘（六）、转染1、PLP1625ng/孔PLP2625ng/孔2ml离心管PLP/VSVG625ng/孔混匀目的质粒625ng/孔Opti培

8、养基500ul/孔2、脂质体6ul/孔2ml离心管请轻混匀，室温下孵育，5minOpti培养基500ul/孔将质粒和脂质体混合，轻轻混匀，室温孵育20min3、吸去细胞培养皿中的培养液，加入3mlPBS清洗，加1ml胰酶，37℃消化，加培养液终止消化；收集于5ml离心管，750rpm，室温，5min；弃上清，加入Opti培养液重悬4、在六孔板中加入850ulOpti培养液