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时间:2020-11-02
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1、(一)干扰引物(shRNA)设计:1、NCBI上下载基因序列2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物(上下游)3、从起始密码(ATG)下游25bp开始;4、GC含量介于40%~60%5、干扰引物至少一个在SDS区,一个在3’UTR区6、选择脱靶率低的(二)、干扰载体构建1、引物退火(引物加水看标签X50,弹匀,瞬离)退火体系:上游:5ul下游:5ul10XMbuffer5ulH2O35ul水浴锅100℃2min,锅里隔夜(三)、酶切plko.1载体1、AgeI酶切,反应体系:plko.1载体4
2、ugAgeI2ul10XAgeIbuffer5ulH2O39ul37℃水浴2~3h2、切胶回收AgeI酶切产物,30ul水洗脱3、EcoRI酶切,反应体系:AgeI酶切产物30ulEcoRI2ul10XHbuffer5ulH2O13ul37℃水浴2~3h切胶回收,30ul水洗脱,测浓度(四)、连接连接体系:T4连接:退火引物2ul退火引物5ul酶切载体1ul酶切载体1ulSolutionI5ulT4连接酶1ulH2O2ulT4连接酶Buffer1ulH2O2ul室温下连接4h。(五)、转化-80℃取感受态细胞于冰
3、上融化,在1.5ml离心管加33ul感受态,将连接产物加入,冰上放置30min,42℃水浴60~90s,冰上放置2min,加入无氨苄培养基,37℃摇床1h,涂布在氨苄平板上,37℃,16h。(六)、挑菌用枪头挑取5个菌落(可送测序)扩大培养,加有氨苄的培养基,37℃过夜培养。(七)、提质粒碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大
4、部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。简明原理:碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性,再将pH值调至中性使其复性,复性的为质粒DNA,而染色体DNA不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去。1、取5ml菌液于离
5、心管,12000rpm1min,弃上清2、向沉淀加500ulP1,震荡重悬3、加入500ulP2,温和翻转6~8次,充分裂解(不超过5min,一般3min)4、加入700ulP3,温和翻转6~8次,出现白色絮状沉淀,12000rpm10min5、将上清加入CS柱(已放入收集管),12000rpm2min,将收集管中液体加入吸附柱CP4中,12000rpm,1min,弃废液6、CP4柱中加入500ulPD,12000rpm,1min,弃液7、CP4柱中加入600ulPw,室温放置3min,12000rpm,1min
6、,弃液8、空离12000rpm,2min,室温放置几分钟(把乙醇蒸发)9、CP4柱置于1.5ml离心管,向柱中心加35ulddH2O,室温放置2min,12000rpm,1min。(三)、测质粒浓度打开软件,ddH2O清洗仪器3~5次,点击black,F1,结果不大于0.2每个样品吸取1ul,于仪器上,F1,结果浓度大于500,OD值1.88~1.90质粒置于-20℃,保存(四)、细胞复苏1、37℃预热PBS,取8mlPBS于10ml离心管中2、液氮中取出冻存的细胞,37℃水浴融化3、吸取冻存细胞于PBS中,轻混
7、匀,室温800rpm3min,去上清,加入1ml培养基重悬,4、细胞重悬液加到含8ml培养基的培养皿中,37℃,5%CO2,培养(五)、细胞分盘1、吸去培养液,加入PBS清洗2、吸去PBS,加入1ml胰酶,37℃培养箱消化1min3、用巴氏吸管加入2ml培养液终止消化,用枪头冲洗培养皿,将液体转到5ml离心管中,750rpm,室温,5min4、加入1ml培养液重悬,按1;3分盘(六)、转染1、PLP1625ng/孔PLP2625ng/孔2ml离心管PLP/VSVG625ng/孔混匀目的质粒625ng/孔Opti培
8、养基500ul/孔2、脂质体6ul/孔2ml离心管请轻混匀,室温下孵育,5minOpti培养基500ul/孔将质粒和脂质体混合,轻轻混匀,室温孵育20min3、吸去细胞培养皿中的培养液,加入3mlPBS清洗,加1ml胰酶,37℃消化,加培养液终止消化;收集于5ml离心管,750rpm,室温,5min;弃上清,加入Opti培养液重悬4、在六孔板中加入850ulOpti培养液
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