第二章 沉淀法ppt课件.ppt

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1、第二编纯化方法主要讲解分离蛋白质和核酸等物质的常见方法第二章沉淀法沉淀法是纯化生命大分子物质常用的一种经典方法。该法操作简单、成本低廉。一般包括：盐析沉淀有机溶剂沉淀选择性沉淀等类型。第一节基本原理与沉淀类型一、基本原理沉淀法也称溶解度法纯化基本原理是：根据各种物质的结构差异来改变溶液的某些性质，就能致使抽提液中有效成分的溶解度发生变化。结构差异：如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团之间比例的差异某些性质：如pH、极性、离子强度、金属离子等换句话说就是：不同的物质置入相同的溶液，溶解度是不同的；相同的物质置人不同的溶液，溶解度也是不同的。二、制备蛋白质1．盐析法盐析法的根据是：蛋白质在稀盐溶液中

2、，溶解度会随盐浓度的增高而上升(盐溶saltingin)，但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出(盐析saltingout)。粗提取液一定浓度范围的盐溶液(如0~25％饱和度硫酸铵)离心分离（得上清液）一定浓度范围的盐溶液(如25％-60％饱和度的盐溶液)离心法收集的沉淀物（初步纯化）杂质呈盐析状态，有效成分呈盐溶状态有效成分呈盐析状态，杂质呈盐溶状态盐析法的一般操作步骤是(1)盐分级沉淀①盐的选择常选用的盐是硫酸铵。因为硫酸铵与其他盐(如氯化钠、硫酸钾等)相比，有以下优点：溶解度大，对温度不敏感。分级效果好。有稳定蛋白质结构的作用。价格低廉，废液可以肥田。缺点：得到的

3、样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。②硫酸铵盐析A．固体法在大体积的粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，当加到一定饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。例如，在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和度达35％时，尿素酶基本上仍留在溶液中；而饱和度达55％时，尿素酶几乎全都沉淀出来(见表2-1)。欲将蛋白质溶液变成一定饱和度硫酸铵溶液时，需要加入的硫酸铵数量可从表2-2（P25）查得，也可用下列公式计算：g：表示在一升溶液中需加入固体硫酸铵的克数；S2：表示要求达到的百分饱和度。S1：表示原溶液中的百分饱和度。B．饱和溶液法这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温和的方法。其操作是在蛋白质溶液中逐步加入预先调好pH的饱

4、和硫酸铵溶液。不同饱和度所需的硫酸铵量可用下列公式计算：V=V0[（S2-S1）/（S3-S2）]式中，V表示需要加入硫酸铵溶液的体积(ml)；Vo表示原来溶剂的体积(ml)；S2表示要求达到的百分饱和度；S1表示原溶液中的百分饱和度；S3表示需要加入硫酸铵溶液的饱和度(一般用百分之百的)。C．透析法将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度。(2)盐析曲线制作用盐析法沉淀欲分离样品时，所需浓度范围要通过试验确定。具体步骤如下：A.分级沉淀取一定体积已测含量之蛋白质或酶的待分离溶液，调节pH至稳定范围，分6~10次加入不同量的硫酸铵：第一次加硫酸

5、铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，则得到第二个分级沉淀部分。如此连续进行，便可得到6~10个分级沉淀部分。B.作盐析曲线将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜pH缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图，即可得到如图2-1所示的典型盐析曲线。C.确定最佳盐析范围在此曲线基础上，参照表2-3的分级试验方法，可根据生物材料来源的难易程度，以及对有效成分纯度和收得率的需求，先找出有利于提高纯化倍数或得率的大致分级框架，然后经过反复试验就能确定最佳盐析范围。从表2-3可以看出，若生物

6、材料来源容易，主要是考虑提高纯化倍数时，选择48％-65％盐饱和分级范围，酶的纯化倍数可达3.0，而得率仅为75％；若生物材料来源较困难，主要是考虑提高收得率时，则选择45％~70％甚至45％~75％盐饱和分级范围，酶的收得率可达80％以上，而纯化倍数将≤2．4。盐析小结A.分级沉淀；B.作图盐析曲线：测蛋白质或酶含量；作盐析曲线图（以蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系）；C.确定最佳盐析范围：反复试验，确定最佳盐析范围（材料来源的难易，有效成分纯度和收得率的需求）。(3)盐析的影响因子①盐析常数(KS)实验证明，每种蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度之间存在下列关系，即溶解度(

7、S，以mg／ml表示)的对数值与溶液中盐的浓度(M)成反比例关系，可用下面的公式表示：lgS=β-KS·M式中，S表示有效成分在水中的溶解度；M表示摩尔浓度；KS表示有效成分在特定条件下的恒定值(见表2-4)，其大小即表示有效成分之溶解度降低的速率与盐浓度的关系。KS值大，则意味着有效成分溶解度降低的速度是随着盐浓度的增加而快速降低(即沉淀加快)。因此，对一种有效成分而言，KS值越大，分级范围越窄