沉淀法生物分离工程课件.ppt

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1、4沉淀法(precipitation)生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(沉淀/超过滤/萃取)纯化(层析、离子交换、吸附)脱盐(凝胶过滤、超滤)浓缩(超滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性什么是沉淀法？沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？常用的沉淀方法包括哪些？何谓盐析？其原理是什么？常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？有机溶剂沉淀法的原理是什么？影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？等电点沉析的工作原理是什么？通过本章学习应掌握以下内容沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低

2、而形成无定形固体沉淀的过程。沉淀法的目的：通过沉淀达到浓缩的目的；沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步纯化；将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。16.1概述沉淀法的原理：生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性

3、都会使溶质的溶解度产生明显的改变。16.1概述沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：概述沉淀法操作步骤：①首先加入沉淀剂，②沉淀剂的陈化，促进粒子生长；③离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。概述沉淀生成动力学溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相互碰撞由下面几种运

4、动引起：①热运动，Bromnian运动；②对流运动，由机械搅拌产生；③差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。为了简化沉淀过程动力学，可把沉淀过程分成下述６个步骤：(1)初始混合(2)新相生成(3)布朗运动凝集(4)机械碰撞凝集(5)聚集体陈化(6)聚集体沉淀沉淀生成动力学沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。优点：操作简单、经济、浓缩倍数高缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强概述沉淀法的分类根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶

5、剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）复合盐沉淀法等（7）亲和沉淀法（8）选择性沉淀法。16.1蛋白质的溶解特性蛋白质是两性高分子电解质（amphotericpolymer），主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质的溶解特性蛋白质的

6、溶解行为由其组成、构象以及分子周围溶液性质所决定。蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。防止蛋白质凝聚沉淀的屏障⑴蛋白质周围的水化层（hydrationshell)，保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质形成稳定的胶体溶液。⑵蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。16.２盐析Saltinducedprecipitation盐析概念：在高浓度的中

7、性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。盐析是可逆的，而变性是不可逆的早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。盐析法机理（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）破坏水化膜，暴露出憎水