基于ssr标记清凉峰地区三叶海棠遗传多样性探究

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1、基于SSR标记清凉峰地区三叶海棠遗传多样性探究　　摘要：20【目的】评价清凉峰地区三叶海棠的遗传多样性水平，为其保护提供理论依据。【方法】利用10对SSR引物，对清凉峰地区的36份三叶海棠样品进行了遗传多样性分析，并从中随机抽取6，9，12，15，18，27，34株大小不同的样本，组成7个群体进行遗传多样性特征比较。【结果】（1）10对引物在36份样品中的多态性等位基因数（Na）平均值为7.1（5.0～10.0），有效等位基因数（Ne）平均值为3.954（1.527～5.786），平均观察杂合度（Ho）为0.781（0.194～1

2、.000），平均期望杂合度（He）为0.699（0.345～0.827），香农多样性指数（I）平均值为1.458（0.662～1.918）；（2）采用UPGMA法构建的系统树中，很明显地将36份供试样品划分为两组，与用贝叶斯聚类方法得到的结果一致，对三叶海棠所有样品进行的主成分分析进一步证实了以上结果；（3）群体样本量≥15株时，样本量就不会对群体内遗传多样性水平、遗传一致度及群体内等位基因数目产生明显的影响。【结论】清凉峰地区三叶海棠的遗传多样性水平较高，其群体明显分化为2个基因源，三叶海棠群体遗传多样性研究和种质收集保存中的适

3、宜样本量为≥15株，研究供试样品可以反映清凉峰地区三叶海棠遗传多样性的总体水平。关键词：三叶海棠；SSR；遗传多样性；适宜样本量中图分类号：S661.4文献标志码：A文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0008-08三叶海棠[Malussieboldii（Regel）Rehd.]是蔷薇科（Rosaceae）苹果属（MalusMill.）的多年生木本植物，是重要的苹果砧木资源[1]。世界地域范围内主要分布在中国、日本和朝鲜等地。在中国三叶海棠分布于从南到北的十多个省区[2]。位于浙江临安和安徽绩溪交界处的清凉峰地区，由

4、于国家自然保护区的设立，保存了较完整的三叶海棠的自然居群[3]，但迄今为止还缺乏对其遗传多样性的评价。20随着分子生物学技术的发展，利用分子标记检测植物的遗传多样性水平，在其他苹果属植物如小金海棠[4]、变叶海棠[5]、山荆子[6]、新疆野苹果[7]、观赏海棠[8]等都得到了应用。然而迄今为止，对三叶海棠的研究主要集中在其作为苹果砧木的抗性生理[1]、营养成分和生物学特性[9]等方面。近年来，微卫星荧光标记技术由于其高度智能化的特点，工作效率高，数据准确[10]，已经广泛应用到遗传多样性的研究中[11-12]。为此，研究运用微卫星

5、荧光标记技术，对清凉峰地区的36份三叶海棠样品的遗传多样性进行分析，并从中随机抽取6，9，12，15，18，27，34株不同大小的样本量组成7个群体进行遗传多样性特征的比较，以期从DNA水平上分析该地区三叶海棠的遗传多样性水平，为今后更加合理地收集和保存三叶海棠种质资源提供参考和理论依据。1材料和方法1.1植物材料供试的36份样品采自位于浙江省临安市与安徽省绩溪县交界的清凉峰地区的三叶海棠自然居群。于春季采集生长状况良好植株的健康幼嫩叶片，按采集顺序编号，放入装有变色硅胶的自封塑料袋中，迅速干燥，带回实验室，用于DNA提取。为了使

6、采集的样品具有代表性和避免采集植株的遗传一致性，从居群的某一植株开始，散射状采集而且保证采集单株之间的间隔大于20m。1.2方法1.2.1DNA提取采用CTAB法[13]从硅胶干燥的叶片中提取总DNA，稀释到10～30mg·L-1，储存在-20℃备用。1.2.2SSR标记随机抽取8个样品的DNA用62对SSR引物进行扩增，将扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶上60W功率下电泳约2.5h，电泳后银染显色。Bio-RadGelDoc2000凝胶成像仪（Bio-Rad20Laboratories，Hercules，CA，USA）拍照记录。从

7、62对SSR引物中筛选出17对扩增条带清晰稳定且多态性丰富的引物，因其中部分引物位于相同的连锁群上，遗传距离较近，所以对位于相同连锁群的引物进行筛选，选出位于不同连锁群的10对引物进行SSR扩增。筛选出的10对引物包括从苹果属植物中开发的7对基因组SSR引物：CH02D08、CH01F02、CH03G12、CH02B10、CH01H01[14]、Hi21e04、Hi02f06[15]，2对EST-SSR引物：MES122、MES17[16]及梨属中开发的基因组SSR引物KA14[17]（表1）。为了实现微卫星多态性的荧光半自动检测

8、，对筛选好的引物进行荧光修饰，在单向引物的5’端加上荧光修饰基团，荧光引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR体系总体积为15μL，其中包括模板DNA10～20ng，上、下游引物各0.4μmol·l-1，dNTP200μmol·L-1，MgCl2