人类白细胞抗原B27三种检测方法的对比.doc

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1、人类白细胞抗原B27三种检测方法的对比王玉红王妍妍李强(新乡医学院第一附属医院血液病研究室河南新乡453100)【摘要】目的比较疑似强直性脊椎炎(AnkylosingSpondylitis,AS)患者HLA-B27检测方法的特点，探讨不同检测方法之间差异及各自优缺点，为临床检验提供参考。方法采用最常见微量淋巴细胞毒试验(MLCT),ELISA法，流式细胞仪法(FCM),对120例疑似(AS)患者的HLA-B27抗原进行检测。将三者结果进行比较分析。结果微量淋巴细胞毒法检测强直性脊椎炎患者阳性率HLA-B27为39.2%；ELISA法检测HLA-B27阳性率45%；流式细胞仪法检测HL

2、A-B27阳性率40.8%。结论三种检测方法之间具有较高的一致性【关键词】强直性脊椎炎人类白细胞抗原B27人类白细胞抗原(HLA-B27)是组织细胞上受遗传控制的个体特异性抗原，其位于人的第6号染色体HLA.基因B座位点上27等位基因［1］。主要症状为腰疼、脊椎僵硬、运动受限。X线显示有两侧龈骼关节炎为其特征的疾病.笔者对疑似AS患者，采用不同的实验方法进行HLA-B27检测、比较，以便为临床提供更准确的诊断依据。1一般材料选择本院门诊或住院主诉腰疼、关节疼的患者120例，男56例，女64例，年龄14〜56岁，平均年龄36.8岁，按不同的实验要求抽取恰当的血标木备用。2试剂与方法2.

3、1微量淋巴细胞毒试验(MLCT)原理：待检的淋巴细胞表面的HLA—B27抗原与己知的HLA—B27抗体结合，在补体的参入下，导致细胞膜溶解，能透过染料使细胞着色，在显微镜下判断HLA・B27为阳性，不着色为阴性。试剂与器材：(1)试剂：肝素抗凝剂；淋巴细胞分离液(上海试剂二厂生产)；HLA-B27六孔抗体反应板检测板；兔补体；染色液；固定液。(2)器材：10ml玻璃试管；玻璃吸管或一次性塑料吸管；离心机；冰箱；恒温箱；连续lul加样器；连续5ul加样器；普通显微镜或倒置显微镜。方法：(1)抽取静脉血5ml用肝素抗凝。(2)用缓冲液将抗凝血2—3倍稀释、混匀。(3)加于装有2ml淋巴细

4、胞分离液试管中的液表面上。离心20分钟。(4)吸出淋巴细胞层于另一试管，加缓冲液洗涤三次，离心2000转/分，10分钟。(5)调细胞浓度为2.5—3.0×106/ml。(6)取出HLA—B27反应板，几分钟复温后，将淋巴细胞悬液加于HLA—B27反应孔,每孔lul,放置22±2°C,30分钟。(7)兔补体于每反应孔中加5ul,22±2°C,60分钟。(8)加染色液5ul,5分钟后加5ul固定液固定细胞。置室温2小时后观察结果。结果判断：在普通显微镜低倍视野观察反应孔中细胞。阴性：活细胞，呈圆球形,闪光，不着色。阳性：死亡细胞，扁圆形，不闪光，着

5、色。死亡细胞率在50%以上为阳性孔，3个以上反应孔阳性者，可报告HLA-B27阳性。2.2ELISA法测定HLA-B27方法：样本血清101倍稀释；分别取10ul稀释样本血清和标准品(直接用)10ul分别加入反应板孔中，每孔加入100ul酶联物，混匀，室温45分钟，馅水洗板5次;每孔加入100ul终止液混匀,5分钟后,30分钟内，酶标仪上450nm波长测定OD值，从标准曲线上查出浓度。HLA・B27<35U/ml为阴性，HLA-B27>35U/ml为阳性。2.3流式细胞术(FCM)流式细胞术所用HLA-B27试剂盒、溶血素及流式细胞均为BD公司产品；利用流式细胞仪对细胞进

6、行分选，进行快速分析。流式细胞术测B27的方法是取50ul抗凝血加入1:10稀释的裂解液，去红细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤一次，再离心弃上清，调整细胞悬液加入30ul的抗HLA-B27FITC/CD3PE,室温避光15分钟，上机测定，以标记阳性细胞数大于90为B27阳性。表：MLCT、ELISA及FCM3种方法120例疑似脊柱炎患者的HLA-B27结果3讨论强直性脊柱炎(AnkylosingSpondylitis,AS)是一种慢性、进行性和炎性疾病,主要累及骰骼关节及四肢关节，表现为关节炎症和增生,晚期美节融合，病人出现疼痛，活动受限,严重者失去劳动能力。过去曾把AS误认为类风

7、湿关节炎的一个亚型。研究发现，AS患者中B27阳性显著高于正常人，而类风湿关节炎患者中HLA-B27频率与正常人无显著差异，这就从遗传学角度证明AS与类风湿关节炎不是一种疾病。因此认为HLA-B27的检测可作为AS的筛选方法［2］。目前检测HLA-B27的方法有补体依赖性微量淋巴细胞毒试验、玫瑰花法，ELISA法，流式细胞术法、PCR/SSP法等［3,4］。在此，笔者选择微量淋巴细胞毒试验、ELISA法、流式细胞术法三种方法检测比较发现：试验结果有较高的一