使用荧光检测法替代MTT检测法进行抗癌药物筛选的可行性.doc

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1、使用荧光检测法替代MTT检测法进行抗癌药物筛选的可行性吴春扬吴风娟李大伟(上海交通大学药学院上海闵行200240)【摘要】我们提出一种新型的基于体外细胞株增殖抑制的药物筛选方法，该方法使用了绿色荧光蛋白(GFP),既简单又省时可靠。我们的实验数据显示，使用绿色荧光蛋白的结果比MTT测定法更加一致可靠。我们的数据还证实了新的检测方法在细胞生长曲线的灵敏度和精度、抗癌药物的抑制作用、剂量反应。【关键词】体外细胞株药物筛选EGFPMTT【中图分类号JR979.［文献标识码】A［文章编号】2095-1752(2012)11-0032-03药物筛选是药物研发领域

2、中的主要方法。可靠性和有效性是评价药物筛选方法好坏最重要的两个指标。目前，MTT法已经成为一种被广泛使用的检测细胞增殖抑制的标准方法［l］o这个经典细胞增殖检测方法的可靠性和灵敏度取决于很多因素，存在的一些易出错步骤也为其他更有效、更可靠、更方便的药物筛选方法提供了足够的发展空间［2］o在本文中，我们研发了一种简单的基于体外细胞株的荧光检测法，获得使用稳定转染U2OS-EGFP细胞的细胞成活率。运用此方法，我们可以通过测量细胞裂解物的绿色荧光来确定细胞增殖或抑制的情况，因为细胞裂解物的荧光读数直接反映了成活细胞的个数［3］oEGFP中的绿色荧光(GF)

3、,激发主峰值在488nm,发射主峰值在507nM，和其他绿色荧光蛋白相比有更长的半衰期［4］。一实验材料和方法：MTT溶液(5mg/ml用磷酸缓冲液(PBS)配制,pH=7.4),DMSO购买自Sigma-Aldrich化学品有限公司(St.Louis,M0),由杜尔贝科改良的鹰培养基(DMEM)购买自Gibco(GrandIsland,NY),胎牛血清(FBS),NP40细胞裂解缓冲液购买自Sigmao阿霉素，戊烷月米。所有的药品和化合物均溶解于DMSO+o1%的DMSO常被用于药物筛选方法的样本管理，因为大多数细胞培养基能溶解于这个浓度[5]o二培

4、养稳定的U20S-EGFP细胞株(UGFP-DK1)U20S细胞是由pEGFP-Nl感染病毒核酸的细胞株质体放在24单元格培养皿中培养。在感染病毒核酸后的24小时内细胞株就被转移到10厘米培养皿中培养2周培养基中含有400μg/毫(,)升G418为主的培养液辅以增加10%胎牛血清(,)和1%的抗生素(购自北京Solarbio科学和技术(,)),每隔2.3天更换一次培养基。通过对受感染细胞株稳定增殖过程中选择和测量不同浓度细胞的荧光度。我们选择高荧光度增殖细胞用作药物筛选。U2OS-EGFP4F12G细胞株(UGFP-DK1)被选为药物筛选细胞株。

5、三绿色荧光检测一开始在DMEM中培养UGFP-DK1,细胞培养基辅以10%胎牛血清、1%抗生素，培养至观察到生长阶段(至少2代，每次有80%的细胞融合)。这些细胞使用胰蛋白酶缓冲进行胰蛋白酶化，期间需要对细胞计数并更换新鲜的培养基。然后使用多通道移液管移将细胞移进入96单元格培养皿中(一般为3×103个细胞/单元格，除非另有说明)，每个单元格拥有200μl培养基(重复3.5次)。在37°C及5%C0的恒定环境中培养4到6个小时。当细胞已经附在培养皿壁上，原有培(2)养液被吸走，选择一定浓度的药物(化合物)和溶媒介质(用DMSO来控制)

6、混合在培养基中(事先准备好)进行替换，然后继续在37°C及5%CO2恒定环境中进行培养。在选择培养好的细胞株后，培养基被完全吸走，加入150μl溶菌液(1%NP-4O)进行补充。将培养皿振荡20分钟。从培养皿的每个单元格中取100μl溶菌后的细胞转移到96单元格的白色条板中。用激发主波长为488纳米、发射主波长为507纳米、频带宽度为5的酶联免疫吸附测定仪测定萤光度。裂解缓冲液被用做对细胞荧光度的抑制作用。所有不同药物浓度测试需要对每一块培养皿重复测试3-5单元格。四MTT法检测细胞株的培养要增殖两代，每次细胞的融合度要达到有80-90%。

7、等细胞重复在新鲜的培养基中培养并胰酶蛋白化后用多通道移液管将细胞移至体积为200μl微量滴定盘中，微量滴定盘具（,）有96单元格,每单元格有3000-5000个细胞。培养盘在37°C的恒定环境中培养4-6小时,使细胞贴壁。然后吸走原培养基，加入事先准备好的含有一定浓度药物的培养基200μL这些细胞在37°C及5%CO2的恒定环境中培养。在药物暴露前4小时加入20μl的MTT溶液。当药物暴露结束时加入150μIDMSO溶液使细胞的酶反应停止。将盘子振荡15分钟后用550纳米波长测量细胞外径。所有不同药物浓度测试需要对每一块培养皿重

8、复测试3.5单元格。控制要求每个培养单元格中有培养基，每个单元格中的细胞都在DMSO培养液中。