用胰蛋白酶酶解蛋白的基本方法.doc

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1、附件1：用胰蛋白酶酶解蛋白的基本方法基本原理：将蛋白样品还原并烷基化后，用胰蛋白酶把蛋白酶解成肽段，然后用液相色谱/质谱仪对其进行分析。试剂、生产厂家以及产品编号：ReagentManufacturerCatalog#IodoaceticacidPierceEndogen35603GuanidineSIGMAG-4505Dithiothreitol(DTT)BIO-RAD161-0611Centriconfilters(10000Da)Millipore42407AmmoniumbicarbonateSIGMAA-6141TrpsinPromeg

2、aV511C使用方法：1.取约1毫克的总蛋白样品放入离心管中，加入1毫升6M的Guanidine(配制在100mMNH4HCO3中，PH8.0)溶液，得到1mg/mL的蛋白溶液。2.加入20微升1M的DTT到上述离心管中，震荡混合5秒钟。3.将上述离心管恒温在37℃条件下反应1小时(以还原蛋白中的双硫键)。4.加入25微升1M新鲜配制在1MNaOH中的Iodoaceticacid，在避光、室温条件下放置30分钟。5.将以上样品平均注入两个(每个约注入500mL)具有分离10kDa以下蛋白的Centriconfilter，以12000rpm离心50

3、分钟。6.在以上离心管中分别加入200mL0.1M的NH4HCO3，并离心30分钟。多次重复此操作，以使蛋白样品中的Guanidine含量降到0.5M左右。7.将以上两个离心管滤层上的蛋白样品，分别、多次加入总量约500mL0.1M的NH4HCO3溶液以完全溶解，并将这些含有蛋白样品的溶液转移到装有20mL的Trypsin试管中，再加入500mL0.1M的NH4HCO3溶液。使试管中液体的总量为1000mL，Trypsin约占总量的1/50。8.将上述试管恒温在37℃水浴中反应16小时。9.分别吸取上述样品500mL到两个Centriconfil

4、ter中，以13400rpm离心50分钟。这样可以除去多余的Trypsin，终止酶切反应。(为节省时间，这里的过滤步骤可省略)10.将上述两个离心管下部的滤出液收集到一个离心管中，在35℃下真空干燥浓缩60分钟。此过程有助于NH4HCO3的分解并挥发，降低样品中盐的浓度。继续干燥浓缩至样品量到100mL左右。11.加0.1%的甲酸溶液定量到所需要的样品浓度，并注意观察样品溶液是否澄清。若样品溶液有浑浊状，需在12,000-14,000rpm条件下离心10分钟，取上清液进样分析。*起始蛋白液不可或只含极微量界面活性剂。