卡介菌纯蛋白衍生物.doc

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1、卡介菌纯蛋白衍生物KajiejunChundanbaiYanshengwuPurifiedProteinDerivativeofBCG(BCG－PPD)本品系用卡介菌经培养、杀菌、过滤除去菌体后纯化制成的纯蛋白衍生物，用于结核病的临床诊断、卡介苗接种对象的选择及卡介苗接种后机体免疫反应的监测。1基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。卡介菌纯蛋白衍生物（BCG－PPD）生产车间必须与其他非卡介菌生物制品生产车间及实验室分开,原液生产全部过程，包括卡介菌的灭活，应在完全隔离的区域内进行,所需设备及器具均须单

2、独设置并专用。直接用于生产的金属或玻璃等器具，应经过严格清洗及灭菌处理。从事BCG－PPD生产的工作人员必须身体健康，经X射线检查无结核病，且每年经X射线检查1～2次，可疑者应暂离该制品的制造。2制造2.1菌种生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。2.1.1名称及来源采用卡介菌D2PB302菌株。2.1.2种子批的建立应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。2.1.3种子批的传代自工作种子批启开至菌体收集传代应不超过12代。2.1.4种子批菌种的检定2.1.4.1染色镜检菌体染色后镜检为短粗杆菌、微弯曲两

3、端圆，抗酸染色阳性。2.1.4.2培养特性于37～39℃培养时，在苏通马铃薯培养基发育成干皱成团略呈浅黄色菌苔。在牛胆汁马铃薯琼脂培养基为浅灰色黏膏状菌苔。在苏通培养基卡介菌应浮于表面，为多皱、微黄色的菌膜。2.1.4.3毒力试验用TB-PPD皮肤试验（皮内注射0.2ml，含10IU）阴性的、体重300～400g的同性豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液（5mg/ml），每周称体重，4～5周后解剖检查，大网膜上可出现脓疱，肠系膜淋巴结可能肿大，肝及其他脏器应无肉眼可见的结核病变。2.1.4.4无有毒分枝杆菌试验用TB-PPD皮肤试验（皮内注射0.2m

4、l，含10IU）阴性的、体重为300～400g的同性豚鼠6只，于股内侧皮下各注射1ml菌液(10mg/ml)，注射前称体重，注射后每周观察1次注射部位及局部淋巴结的变化，每2周称体重1次，豚鼠体重不应降低。6周时解剖3只豚鼠，满3个月时解剖另3只，检查各脏器应无肉眼可见的结核病变。若有可疑病灶时，应做涂片和组织切片检查，并将部分病灶磨碎，加少量生理氯化钠溶液混匀后，皮下注射2只豚鼠，若证实系结核病变，该菌种即应废弃。当试验未满3个月时，豚鼠死亡则应解剖检查，若有可疑病灶，即按上述方法进行，若证实系结核病变，该菌种即应废弃。若证实属非特异性死亡，

5、且豚鼠死亡1只以上时应复试。2.1.5种子批的保存冻干菌种保存于8℃以下，液体菌种保存于-70℃以下。2.2原液2.2.1生产用种子启开工作种子批菌种，在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基或液体苏通培养基上每传1次为1代。在马铃薯培养基培养的菌种置冰箱保存，不得超过2个月。2.2.2培养基采用苏通马铃薯培养基、改良苏通综合培养基或经批准的其他培养基。2.2.3菌种接种和培养挑取发育良好的菌膜移种于改良苏通综合培养基或其他培养基的表面，置37～39℃静置培养8～10周。凡在培养期间或培养终止时，有菌膜下沉、发育异常或污染杂菌者，必须废弃。2.2.

6、4收获及杀菌培养终止，将培养物于121℃30分钟杀菌，过滤除去菌膜及菌体。如滤液需保存，应加入3.0g/L苯酚或其他适宜的防腐剂，于4～8℃保存，保存期不超过30天。2.2.5纯化收集滤液进行纯化。用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白质，采用经批准的方法纯化，除菌过滤后即为原液。2.2.6合并及冻干2.2.6.1合并将不超过5次纯化的原液进行合并。2.2.6.2分装及冻干原液检定合格后，可根据蛋白质含量，将原液稀释至规定浓度，定量分装，分装后立即冻干。2.2.7原液检定按3.1.1项进行。2.2.8保存及有效期原液应于2～8℃保存。液体原液自效

7、价测定合格之日起有效期为5年；原液冻干品自效价测定合格之日起，每隔5年应按3.1项进行检定，合格后可继续使用。2.3半成品2.3.1配制经检定合格的原液，用0.01mol/LPBS（pH7.2～7.4，含0.0005%聚山梨酯80及3.0g/L苯酚）稀释至50IU/ml。稀释时充分摇匀，并逐瓶做无菌检查（附录ⅫA）2.3.2半成品检定按3.2项进行。2.4成品制备2.4.1分批应符合“生物制品分批规程”规定。2.4.2分装应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。2.4.3规格每瓶1ml、2ml。每1次人用剂量为0.1ml，含BCG-PPD5IU。

8、2.4.4包装应符合“生物制品包装规程”规定。3检定3.1原液检定3.1.1外观原液冻干品应为白色疏松体。液体原液及冻干品复溶后应呈棕黄色澄明液体，无