布氏菌纯蛋白衍生物doc

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1、布氏菌纯蛋白衍生物 BushijunChundanbaiYanshengwu PurifiedProteinDerivativeofBrucellin(BR-PPD) 本品系用布氏菌经培养、杀菌、除去菌体后的上清液制成的纯蛋白衍生物，用于布氏病的临床诊断、布氏菌苗接种对象的选择及布氏菌苗接种后机体免疫反应的监测。 1基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 布氏菌纯蛋白衍生物（BP-PPD）生产车间必须与其他生物制品生产车间及实验室分开,原液生产全部过程，包括布氏杆菌的灭活，应在完全隔离

2、的区域内进行,所需设备及器具均须单独设置并专用。直接用于生产的金属或玻璃等器具，应经过严格清洗及灭菌处理。 2制造 2.1菌种 生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。 2.2.1名称及来源 采用猪布氏菌Ⅰ型CMCC55007(S2)菌株。 2.1.2种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。 2.1.3种子批的传代 工作种子批启开至菌体收集传代应不超过5代。 2.1.4种子批菌种的检定 2.1.4.1染色镜检 菌体染色后镜检应为革兰阴性小杆菌。 2.1.4.2生化特性 1∶1000

3、三胜黄素做变异检查应为阴性；在硫堇培养基能生长；在碱性复红培养基不生长；培养生长中可产生明显的硫化氢，不需二氧化碳。 2.1.4.3血清学特性 生产用菌种对布氏菌参考血清的凝集效价应达到1∶800(++)以上。 2.1.4.4噬菌体裂解特性 能被布氏菌Wb噬菌体裂解。 2.1.5种子批的保存 冻干菌种保存于8℃以下，液体菌种于-70℃以下保存。 2.2原液 2.2.1生产用种子 启开菌种后接种于肝琼脂斜面培养基，置37℃培养2～3天，根据生长情况，可在肝琼脂斜面上再传代1次，生长良好的菌苔，可供大量接种使用。 2.2.2生产用培养基

4、 采用肝浸液琼脂培养基或经批准的其他培养基。 2.2.3菌种接种和培养 取2.2.1项生长良好的菌苔，接种于适量的大管肝斜面或克氏瓶中作为种子，置37℃培养2天。用以接种的大管肝斜面或肝琼脂克氏瓶，于37℃培养2天。 2.2.4收获及杀菌 培养终止，以生理氯化钠溶液洗脱培养物，121℃30分钟杀菌，杀菌后离心除去菌体，收集上清液。如上清液需保存应加入3.0g/L苯酚或其他适宜的防腐剂，保存于4～8℃，保存期不超过30天。应防止冻结。 2.2.5纯化 收集上清液进行纯化。用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白质，采用经批准的方法纯化，除

5、菌过滤后即为原液。 2.2.6合并及冻干 2.2.6.1合并 将不超过5次纯化的原液进行合并。 2.2.6.2分装及冻干 原液检定合格后，可根据蛋白质含量，将原液稀释至规定浓度，定量分装，分装后立即进行冻干。 2.2.7原液检定 按3.1项进行。 2.2.8保存及有效期 原液应保存于2～8℃。液体原液自效价测定合格之日起有效期为5年；冻干品自效价测定合格之日起，每间隔5年应按3.1项进行检定，合格后方可继续使用。 2.3半成品 2.3.1配制 经检定合格的原液，用0.01mol/LPBS（pH7.2～7.4，含0.0005%聚山梨酯

6、80及3.0g/L苯酚）稀释至20IU/ml或50IU/ml。稀释时充分摇匀，并逐瓶做无菌检查（附录ⅫA） 2.3.2半成品检定 按3.2项进行 2.4成品制备 2.4.1分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。 2.4.3规格 每瓶1ml、2ml。每1次人用剂量0.1ml，含BR-PPD1IU。 2.4.4包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3检定 3.1原液检定 3.1.1外观 原液冻干品应为白色疏松体。液体原液及冻干品复溶后应呈棕黄色澄明液体，无不溶物或杂质。 3.1.

7、2复溶时间 冻干品按标示量加入注射用水后，应于3分钟内完全溶解。 3.1.3水分 应不高于3.0%（附录ⅦD）。 3.1.4纯度 3.1.4.1蛋白质含量 依法测定(附录ⅥB第二法)。 3.1.4.2多糖与核酸含量 每1mg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0.1mg。 （1）多糖含量测定：以生理氯化钠溶液稀释无水葡萄糖标准品，制备0～100μg/ml标准葡萄糖溶液。将硫酸225ml加入到75ml生理氯化钠溶液中，另称取蒽酮0.6g加入10ml乙醇中，将上述溶液混合，配制成蒽酮混合液。分别精确量取1.0ml不同浓度标准葡萄糖溶液以及本品

8、，加入4.0ml蒽酮混合液，混匀，沸水浴20分钟后于波长620nm处测定吸光度，以葡萄糖标准溶液浓度对应其吸光度，用minitab或其他统计学方法求回归方程，代入本品吸光度，计算多糖含量。 （2）核酸含量测定：取供试品2～3ml，采用