河豚毒-实验法.doc

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1、河豚毒实验法1。白鼠○使用19～21g的出生4周的ddy系或者ICR系的健康的公鼠。2。检验体的提取○河豚的毒性有很大的个体差异，所以需要多条试验体。如果提取的是全鱼体，试料需要用冰或者dryice来冷却搬运，长距离运输时需要用dryice来冻结搬运。检查河豚毒时（鱼种名）是很重要的，所以必要时需要专家的协助。3。试料的制作及萃取（1）醋酸萃取法（高毒性试料的萃取）○将皮和肌肉用剪刀剪细一些，然后用Mixer磨细后，取10g到（烧杯），加0.1％浓度醋酸25ml.放入沸水池中搅拌10分钟，然后冷却过滤，残渣用0.1％浓度醋

2、酸反复清洗，使滤液达到50ml.1ml滤液相当于原试料0.2g.将此滤液封盖冷藏至进行试验1为止。（2）酸性（甲醇）萃取（低毒性试料的萃取）○将皮和肌肉用剪刀剪细一些，然后用搅拌器磨细后，取10g到装有环流冷却管的200ml容积的（长颈瓶）中。加入PH值为3～4的酸性（甲醇），然后连接到环流冷却管，在70～75度温度下加温10分钟。此操作反复进行3次，最后清洗残留物，将滤液合在一起过滤后，减压浓缩。加入蒸馏水用分液漏斗移动后用（乙醚）（）2遍，在水槽中减压除去（天空醚），加入整流水使达到20ml.1ml滤液相当于0.5g.

3、○酸性（甲醇）：在1L（甲醇）中加入20ml的冰醋酸（glacialaceticacid）来制造。4。白鼠试验（1）预备试验○将制毒原液6用蒸馏水稀释成10，100，1000，10000倍。将1ml的稀释液注射到2只白鼠腹腔内，观察发现的症状及死亡。症状表现为毒量大时做1～5分钟向上蹦的动作后死亡。注射最少注射量（1只）时，最初10～15分钟内没有异常，但出现环眼（眼圈出现白带），四肢麻痹，肚子贴地爬行状态，到25分左右时死亡。死亡的判定是通过呼吸及运动的停止来决定，注射到死亡时间准确记录到秒。（2）真实试验○将预备试验中

4、使用的毒液（5～10分钟内死亡时使用的毒液）重新稀释（2倍，4倍，8倍）后，在每个稀释阶段提取1ml毒液，注射到2只小白鼠的腹腔内，如果出现10分钟左右死亡的现象，将此被检毒液1ml再注射到3～5只的小白鼠体内。5．计算○将包括活着的小白鼠在内，由中间死亡时间求表－1的MU.如果小白鼠为19g一下或者21g以上，则由表－2保证各个小白鼠体重的MU后，去中间值。再由得到的MU乘与稀释倍数和提取比，求1g当量的被检体的MU.毒力（MU/g）=由致死时间及体重保证得到的MU×稀释倍数×提取比。表－1致死时间－小白鼠单位换算表表－

5、2小白鼠体重－小白鼠单位保证表6葡萄状球菌试验法1．（）菌培养取被检体25g或者25ml加入到加有225ml10％浓度Nacl的TSB培纸（培纸23）后，在35～37度环境中进行16小时（）菌培养。2．分离培养○将（）菌培养液（接种）到加有蛋黄的甘露醇食盐.琼脂培纸(一种植物胶,用海产石花菜类制成,可作冷食或微生物的培养基等)（培纸14）中，在37度环境下培养16～24小时。培养结果为，加有蛋黄的甘露醇食盐.琼脂培纸中出现黄色不透明的串状物（甘露醇分解），周边有白色环（蛋黄反映养成）的串状物实施确认试验。3．确认试验○将分

6、离培养的平板培纸上的串状物移动到普通琼脂培纸（培纸8）上，在37度环境中培养18～24小时后实施革兰氏染色，确认有葡萄状排列的革兰氏染色阳性球菌。确认葡萄状排列的革兰氏染色阳性球菌后实施凝固酵素试验。将加有兔子的血清（新鲜血清为5％，干燥血清的溶液为10％）的生理盐水灭菌后，部分性的分注0.5~1ml。在这里接种分离培养纸上的串状物或者纯粹培养的菌1（），在37度环境下培养。培养后观察3，6，24小时内，各时间是否有凝固，无论哪个时间之后出现的凝固或者纤维素释出，都将其实施革兰氏养成，而且以上确认都都将判定为葡萄状球菌的养

7、成。（试验中使用凝固酵素培养菌及菌株接种的阴性制造菌）？6亚硫酸，二亚硫酸亚硫酸及其盐类的试验法1．定性试验(1)碘酒活用，淀粉纸法○取液体被检体1～2g到100ml的三角长颈瓶，固体被检体剪碎后搅匀，取1～2g加10ml的水摇匀，加入25％浓度的磷酸5ml，盖上带有碘化钾淀粉纸的盖子。○碘化钾淀粉纸之前先将下端1cm用水浸湿，放到检验液上方1cm左右。如果10分钟之内试验纸不能变为蓝色（一般情况下试验纸的湿的部分的交界面会最先变蓝），将盖子往下放一些，在水槽上加温10分钟，如果还不变蓝，就再次盖上盖子冷却。这时，如果30

8、分钟内试验纸不变蓝，说明没有亚硫酸，二亚硫酸及其盐类。○如果试验纸变蓝，将进行下面的定量试验。○碘化钾淀粉纸：将定量用的过滤纸放入等量的0.2％浓度的碘化钾溶液和淀粉溶液中后，在暗处风干。(2)铅粉还原法○取液体被检体1～2g到100ml的三角长颈瓶，固体被检体剪碎后搅匀，取1～2g加水100ml摇匀。