电感受态细胞制备.doc

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1、根据诸多文献，提出如下红球菌电转化感受态细胞制备方案：1.接种一环红平红球菌/紫红红球菌到LB培养基里，30°C，170转/min过夜培养。2.取1.0-1.5ml过夜培养菌液，4000转/min离心3min,无菌水洗涤，重新离心一次，重悬浮于1.0ml无菌水中。3.转移100uL上述菌悬液到一个装有100mlMB培养基的培养瓶中(MBmedium(5g/l酵母膏,15g/l胰蛋白胨,5g/l大豆蛋白胨,5g/lNaCl,2.0%甘氨酸,1.8%蔗糖，pH7.2。灭菌后加入0.25ug/mL青霉素G)试验最佳生长培养基：LB含0.5M蔗糖；LB含0.5M山梨醇；LB含0.5M甘

2、露醇；LB+0.5M蔗糖+0.5M山梨醇；LB+0.5M蔗糖+0.5M甘露醇；LB+0.5M山梨醇+0.5M甘露醇；MB培养基4.30°C，170转/min振荡培养过夜或者O.D.600值达到0.8-1.0之间。5.用灭菌的离心管（10ml）或者50ml锥形管和适当的适配器在GSA转子里以4000rpm的速度离心10分钟（如果细胞没有沉淀下来，改变离心时间和转速为4000g/min，10min）6.倒掉上清，加入6mL预冷的蒸馏灭菌水，轻轻洗涤，4000rpm的速度离心10分钟。7.倒掉上清，再次将细胞沉淀加入到6mL预冷的5%甘油蒸馏灭菌，水轻轻洗涤，4000rpm的速度离心

3、10分钟。8.用6ml的10%灭菌的冰冻甘油洗涤细胞沉淀一次，4000rpm的速度离心10分钟。（重复一次）9.用6ml的10%灭菌的冰冻甘油洗涤细胞沉淀一次，4000rpm的速度离心10分钟。10.用5ml（20倍浓缩）或更少（40倍浓缩）的灭菌冰冻甘油对细胞沉淀进行重悬浮11.按120μl等份装入灭菌的微型离心管中于-80°C储藏电转化：1.取400uL冷冻红球菌感受态细胞2.加入1uL质粒DNA(0.5ug),轻轻混匀，冰上放置30min(500ng/400ul=125ng/ul)3.将上述感受态细胞—质粒DNA混合物转移到预冷的0.2cm的电击杯内4.设置电击参数为：电

4、压2.5kV,电抗400Ω，电容25.0uF,脉冲7.0ms5.电转后立即加入1mLLB培养基，30℃培养3h6.适当稀释后涂布LB培养基。备注：1.电压：转化效率随电压升高而升高，12kV/cm(即2.4kV÷0.2cm)时转化效率最高，且与所用缓冲液无关2.DNA浓度：当DNA浓度在0.001ug/mL—0.1ug/mL(相当于0.001ng/uL—0.1ng/uL)(质粒/感受态细胞)时，转化效率随DNA浓度升高而升高；即使继续提高DNA浓度到1010ug/mL，其转化效率也保持不变。也就是说DNA浓度在0.1ug/mL—10ug/mL之间保持恒定的转化效率，因此最佳DN

5、A浓度为0.1ng/uL。感受态细胞为400uL时，DNA(40ng/uL)需要40ng(1uL)；感受态细胞为100uL时，DNA需要10ng(0.25uL)电转化：Electroporationisasimpleandwidelyusedtech-niquefortransformationofvariousbacterialspecies.Thistechniqueusesanelectricpulsetreatmentofcellstoinduceamembranepotential（膜电位）whichcausesthetemporarybreakdownofthece

6、llmembranepermeation（渗透,透过）barriertoallowtheentryofDNAintothecells(Tsong,1992).Inprinciple,theinducedmembranepotential,andhenceefficiencyofDNAentryintobacterialcells,increaseswiththestrengthofanappliedelectricfield.However,thepercentageofcelldeathcausedbyelectricaldamagealsoinevitably（不可避免地）

7、increaseswiththeappliedfieldstrength.Asaresult,thetransformationefficiencyisthecombinedeffectofthesetwofactorsunderagiventransformationcondition.Theoptimumelectricfieldstrengthvariesamongvariousbacterialspeciesandisusuallylowerforgram-positivebacte