感受态细胞制备.docx

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1、在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的

2、感受态细胞(Competentcell)。理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。一般来说，感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌制备感受态细胞时，测OD600在0.3--0.5之间，空白用无菌体的LB培养基。感受态的感受效率最关键的是一个冷字，刚制备的感受态其感受效果最好，但是随着时间的延长感受效果会逐渐下降，所以要将制好的感受态细胞冻存于液氮中，或-70度冰箱

3、保存，这样感受效果才不至下降过快。一般感受态制备好以后24小时其转化效率最高，随后就逐渐下降。一般的宿主菌都不要传代太多，传多了就容易状态不好和污染杂菌。状态好的时候建议冻上一批，用EP管分装好，然后，每次就可以取冻存的菌种来扩增使用。实验概要大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细

4、胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-，M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进

5、入的感受态细胞（Compenentcells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。主要试剂(1)0.1mol

6、/LCaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。主要设备(1)超净工作台(2)冷冻离心机(3)恒温摇床(4)－70℃冰箱(5)10mL移液管(6)吸耳球(7)1mL、200μL移液枪（配套枪头）(8)50mL离心管(9)1.5mL离心管实验材料(1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养(1)从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落，接种于3～5mLLB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜（12h左右）。(2)将该菌种悬液以1:100的比例接种，取250μL菌液转接到25m

7、LLB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h至OD600＝0.5左右。（二）感受态细胞的制备（注意：以下操作在超净工作台完成。） (1)将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min。(2)在4℃下，4000r/min离心10min。弃去上清，将管倒置1min以便培养液流尽。(3)用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min。(4)0～4℃4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备）（三）感

8、受态细胞的分装与冻存(1)在2mL制备