资料-组织匀浆制备.doc

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1、组织匀浆的制备1、取组织块0.2g-1.0g，最少可到2～5mg，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入5或10ml的小烧杯内。2、用移液管量取预冷的匀浆介质（ph=7.4,0.01mol/LTris-HCL,0.0001MOL/LEDTA-2Na,0.01mol/L蔗糖0.8％的氯化钠溶液）或者用0.86％冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用移液管或移液器取总量的2/3的匀浆介质或生理盐水于烧杯中，将盛有组织的小烧杯放入冰水中，用眼科小剪尽快剪碎组织块。3、用组织捣碎机10000～150

2、00r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。取少量组织匀浆做涂片（直接涂片、染色均可），显微镜下观察细胞是否磨破，若没有破则可以延长匀浆时间。4、将制备好的10％匀浆用普通离心机或低温低速离心机3000r/min左右离心10～15分钟，将

3、离心好的匀浆留下上清弃下面沉淀。根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种测定。可溶性抗原(solubleantigen)的制备及鉴定蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸等均为可溶性抗原，它们有相当部分来源于组织和细胞，成分复杂。制备这类免疫原时，首先须将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的蛋白或其他抗原，提纯的抗原需鉴定后才能用做免疫原。 关键词：可溶性抗原可溶性抗原solubleantigen糖蛋白脂蛋白细胞匀浆蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸等均为可溶性抗原，它们有相当

4、部分来源于组织和细胞，成分复杂。制备这类免疫原时，首先须将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的蛋白或其他抗原，提纯的抗原需鉴定后才能用做免疫原。一、组织匀浆的制备用于制备免疫原的材料必须是新鲜或低温保存的。材料获得后立即去除包膜或结缔组织，脏器应进行灌洗，去除血管内残留的血液，用含0.5g/LNaN3的生理盐水洗去血迹及污物；在4℃水浴或冰浴中将洗净的组织剪成0.3～0.5cm3小块，加入适量生理盐水，装入捣碎机筒内制成组织匀浆。组织匀浆经3000r/min离心10min后，上清液作为提取可溶性抗原的材料。上清液在提取前还

5、必须进行离心去除细胞碎片及微小的组织。二、细胞破碎提取细胞的可溶性抗原，需将细胞破碎。根据细胞类型不同，选择破碎的方法也有一定的差异，现介绍几种常用的细胞破碎方法。1、酶处理法溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等在一定的条件能消化细菌和组织细胞。如溶菌酶对革兰阳性菌的细胞壁有溶菌作用。酶处理法适用于多种微生物细胞的溶解，该方法具有作用条件温和、内含物成分不易受到破坏、细胞壁损坏程度可以控制等特点。2、冻融法细胞主要因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度突然改变而破坏。其方法是将破碎的细胞置-15～-20℃冰箱内完全冻结，然后从冰箱取出，让

6、其在30～37℃中缓慢融化。如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被破。此法适用于组织细胞，对微生物的细胞作用较差。3、超声破碎法这是利用超声波的机械振动而使细胞破碎的一种方法。由于超声波发生时的空腔作用（cavitation），使液体局部减压，引发液体内部流动，在漩涡生成与消失时，产生很大的压力而使细胞破碎。超声波所使用的频率从1～20kHz不等。进行超声破碎时，需间歇进行，避免长时间超声产热，导致抗原破坏。也可将超声粉碎的细胞置于冰浴降温。超声破碎细胞，方法简单，重复性较好，且节省时间。微生物和组织细胞的破碎，均可采用此方法

7、。4、表面活性剂处理法在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，通过细胞膜的通透性改变使细胞溶解。常用的表面活性剂有十二烷基磺酸钠（SDS阳离子型），新洁尔灭，TritonX-100等。如将大肠杆菌湿菌体1g，加入2%浓度的TritonX-100作用60min，可使绝大多数大肠杆菌的菌体裂解。此方法作用比较温和。在提取核酸时，常用此法破碎细胞。三、蛋白质的提纯蛋白质纯化方法属于生物化学技术，本章只作较简要介绍。1、超速离心法此法分离和纯化抗原的原理是利用各颗粒在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的颗

8、粒处于不同密度梯度层内，达到彼此分离的目的。常用的密度梯度介质有蔗糖、甘油、CsCl等。用超速离心或梯度密度离心分离和纯化抗原时，除个别成分外，极难将某一抗原成分分离出来，故只用于少数大分子抗原的分离，如IgM、C1q，