土壤中分解尿素的细菌的分离与计数-课件.ppt

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1、微生物的类群原生生物：原核生物:真菌:病毒:如酵母菌、霉菌、食用菌单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等无细胞结构真核细胞细菌、蓝藻原核细胞课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数专题二微生物的培养与应用课题背景尿素{CO(NH2)2}----重要的农业氮肥。只有被土壤中的细菌分解成NH3之后才能被植物吸收利用。土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶我们吃的是尿素，吐的是作物需要的“奶”尿素细菌课题目的①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌研究思路㈠.筛选菌株㈡.统计菌落数目㈢.设置对照1、实例：寻

2、找耐高温的DNA聚合酶启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。寻找寻找耐高温的酶耐高温生物耐高温环境（热泉、火山口）PCR技术：要求使用耐高温（93度）的DNA聚合酶㈠.筛选菌株2、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。利用选择培养基15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、所需培养基：①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮

3、源？碳源：葡萄糖、尿素氮源：尿素培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。4、此培养基能选择分解尿素的微生物的原理5、怎样证明此培养基具有选择性呢？以尿素为唯一氮源的培养基牛肉膏蛋白胨培养基是分离尿素细菌判断该培养基有无选择性实验组对照组培养基类型是否接种目的结果只生长尿素细菌生长多种微生物是1、显微镜直接计数：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。㈡.统计菌落数目：

4、不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点：2.间接计数法（活菌计数法）⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。⑵常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。注意事项②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个

5、或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。㈢.设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。原因：⑴土样不同，⑵培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质)小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。方案一：由其他同学用与A同学相同土样进

6、行实验方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。㈡.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。三.实验的具体操作㈠.土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中(取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌)。◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行（三）样品的稀释㈣.取样涂布◆实验时要

7、对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。分离不同的微生物采用不同的稀释度稀释倍数目的细菌104、105、106保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板放线菌103、104、105真菌102、103、104原因：不同微生物在土壤中含量不同㈤.微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：30～37℃培养1～2d放线菌：25～28℃培养5～7d霉菌：25～28℃的温度下培养3～4

8、d。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。微生物的培养与观察四.结果分析与评价1