铵态氮(靛酚蓝比色法).doc

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1、铵态氮（靛酚蓝比色法）方法与原理：土壤浸出液中的NH4+在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝,溶液的蓝色很稳定，在NH4+-N浓度为0.05—0.5mg.L-1范围内，其深浅与NH4+-N含量呈正比.试剂：1.酚溶液：10g苯酚和100mg(0.1g)硝普钠（剧毒）【Na2Fe(CN)5·2H2O】→1L水暗瓶存于4℃冰箱2.次氯酸钠碱性溶液：10gNaOH,7.06gNa2HPO4·7H2O,31.8gNa3PO4·12H2O和10ml次氯酸钠【w(NaOCl)=5.25%】→1L水中暗瓶存于4℃冰箱3.掩蔽剂:①酒石酸钾钠溶液【ρ（KNaC4

2、H4O6·4H2O）】=400g.l-1与EDTA二钠盐溶液【C10H14O8N2Na2】100g.l-1等体积混合.每100ml混合液加入0.5mlNaOH溶液（10mol/L）,即得清亮的掩蔽剂②酒石酸钾钠【KNaC4H4O6·4H2O】400g↓EDTA二钠盐【C10H14O8N2Na2·2H2O】110.7g稀释至2L.每100ml混合液加入0.5mlNaOH溶液（10mol/L）,即得清亮的掩蔽剂4.【ρ（NaOH）】=10mol.l-1：400gNaOH用蒸馏水定容至1L5.NH4+-N标准液：0.4717g烘干的（NH4）2SO4→1L水中(定容)此为

3、NH4+-N贮备标准液。测定当天将此液用蒸馏水水准确稀释20倍（如5ml稀释至100ml）即为NH4+-N标准液【ρ（NH4+-N）=5mg.l-1】操作步骤：1．土壤30g置于150ml三角瓶中加入100ml2MKCl浸提，振荡(140rpm)30min过滤（约30ml以上滤液）2．10ml样液于50ml容量瓶+约20ml水+5ml酚+5mlNaOCl摇匀，在20℃左右置1小时↓1ml掩蔽剂以溶解沉淀物定容50mlλ=625nm比色3．0/0.5/1/2/3/4/5mlNH4+-N标准液于50ml容量瓶+10mlKCl+约20ml水+5ml酚+5mlNaOCl摇匀

4、，在20℃左右置1小时后加入1ml掩蔽剂以溶解沉淀物定容50mlλ=625nm比色注意事项:掩蔽剂应在显色后加入，加入过早，会使显色很慢。加入过晚，易生成氢氧化物沉淀可能老化而不易分解，20℃左右置1小时即可加入掩蔽剂0ml0.5ml1ml2ml3ml4ml5ml↓0mg.L-10.050.10.20.30.40.5计算结果：ρ*V*ts*10-3W（N）=———m———*1000W（N）----土壤中铵态氮（NH4+-N）的质量分数，mg.kg-1ρ-----从工作曲线中查的显色液中氮的浓度，mg.l-1V-----显色液体积，ml（50ml容量瓶）ts----分

5、取倍数（100/10）10-3----将ml换算成L的系数m-----土壤质量，g1000----换算成每kg土含量实验内容四：土壤微生物DNA的提取及鉴定（8学时）1．称土样约0.3g于2ml离心管中，加入1.5ml溶菌酶液（解冻2小时，夏天），混合均匀，并在37℃水浴锅中放置1h，每10min轻轻的摇匀一次，上下颠倒30下左右（拿出pro-k解冻）2．接着在液氮中放置4min（或高速振荡器6000rpm，45s）和65℃水浴锅中放置3min，循环3次3．冷却至室温后，加入15ulpro-k（分装20ul，应先在振荡器振荡一下，再short一下）和75ul10%S

6、DS，55-60℃下培养1h，6000rpm离心5min4．切掉枪头的tip尖端，提取上清液于10ml的离心管中，沉淀再用0.5ml溶菌酶液和0.5ml0.5%SDS洗涤一次，6000rpm离心5min，提取上清液（0.5ml0.5%SDS=25ul10%SDS+475ul纯水）5．然后往离心管中加入等体积（约2.5ml）tris-饱和酚抽提一次，12000rpm离心10min，提上清液1．加入等体积tris-饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提一次，12000rpm离心10min，提上清液2．加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）抽提两次，12000rpm离心1

7、0min，提上清液3．将上清液分装于2-3管2ml离心管中，分别加入0.25倍体积的3M乙酸钠，2倍体积的无水乙醇，于-20℃过夜沉淀4．然后在室温下12000rpm离心10min，去上液10.沉淀用1ml70%乙醇洗涤两次，12000rpm离心10min，去上液11.无水乙醇洗涤一次，12000rpm离心10min，去上液，倒置于吸水纸上，在超净工作台下吹干5min12.重悬于50ulTE中，样品在-20℃冰箱中保存。13.DNA的检测：5ulDNA样品+1ulloadingbuffer，1%琼脂糖凝胶电泳120V,40min，最左边点Marker（样品DNA