纳米银杀菌机理研究.doc

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1、纳米银抑菌机理研究方案纳米银对细菌有抑制作用，但具体机理并不清楚。目前已有很多学者根据纳米银对细菌抑制作用的宏观现象，提出纳米银对细菌抑制机理的推测，如纳米银可能影响微生物细胞的呼吸系统，损伤DNA，破坏细胞膜等。但对细胞壁等方面研究很少。我们将设计实验阐明纳米银对细菌有抑制作用的具体机理。研究的主要内容包括纳米银对细胞壁的破坏的机理，对细胞膜的损害，对细胞呼吸链酶的影响，对DNA损伤等方面，从而明确纳米银对细菌的抑制作用的机理。实验步骤1抑菌试验方法1.1抑菌率实验用系列稀释法制得胶体银溶液浓度为10ppm、20ppm、40ppm、80ppm、100ppm的PB

2、S缓冲液，加入0.2mL菌悬液(大肠菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉，最终培养基中菌液浓度为1×106cfu/mL)，作用20min．然后取1mL混合液投入到9mL的PBS缓冲液中，做系列稀释，取其中3个稀释度，吸取0.5mL置于平皿中迅速用凉至40~45℃的营养琼脂培养基15mL作倾注，转动平皿，使得稀释液与培养基充分混匀，琼脂凝固后翻转平皿，37℃培养24h进行菌落计数。抑菌率计算方法公式：X=(A-B)/A×100％其中：X——抑菌率，A——对照样品中的平均菌落数，B——被试样品的平均菌落数．1.2抑菌圈实验在超净工作台内，将灭菌后的营养琼脂培养基倒入已灭菌的培养

3、皿中，制成平板，用可调式移液器移取1mL浓度为10+8cfu/L的大肠杆菌于无菌的琼脂平板上，5min后，每个牛津杯中加入20μL纳米银溶胶，置于37℃恒温培养箱中培养24h。在菌体生长的同时，样品试液均匀扩散到琼脂平板上，抑制其周围的微生物生长，从而产生不长菌的透明抑菌圈。按互成60°的3个直径方向测量透明抑菌圈直径，计算平均值，从而测量出大肠杆菌纳米银作用下的抑菌圈大小。在相应培养基上以相同的方法测量其它六种菌株的抑菌圈的大小。与细菌不同的是应该将10+7cfu/L酵母菌涂布在YEPD固体培养基上，放置在28℃恒温培养箱中培养48h。2.1纳米银对细胞膜和细胞

4、壁影响2.1.1采用透射电镜观察了经纳米银粒子处理过的大肠杆菌细胞的形态变化过程,观察细胞膜和细胞壁的结构变化2.1.2通过革兰氏染色判断细菌经纳米银处理前后，细胞壁是否发生变化2.1.3测定纳米银处理前后MDA含量的变化，丙二醛（MDA）是常用的膜质过氧化指标，判断膜质过氧化情况。2.1.4测定乳酸脱氢酶(LDH)浓度，乳酸脱氢酶(LDH)是存在于细胞浆内参与糖酵解最后一步即丙酮酸和乳酸相互转化时的一种转化酶，正常情况下，胞外含有少量，但在细胞受损的情况下，就会由细胞漏出至胞外。判断纳米银是否引起细胞膜破裂。菌悬液加入10mmol/了的葡萄糖和纳米银温育，间隔1

5、0min取样，用0.22um孔径的无菌硝酸纤维素膜过滤，滤液测胞外乳酸脱氢酶含量和紫外吸收物质。紫外吸收物质在260nm下测定光吸收值。2.2纳米银对DNA的影响2.2.1用纳米银处理大肠杆菌DNA，通过琼脂糖凝胶电泳观察前后变化。（通过电镜观到经纳米银粒子处理过的大肠杆菌细胞,DNA不再随机分布在细胞的核区,而是在核区浓缩紧张态的现象）2.2.3观察纳米银处理后细菌核区的变化(纳米银使大肠杆菌DNA不再随机分布在细胞的核区，而是在核区浓缩呈紧张态，并增加菌体内总DNA的降解程度)2.3纳米银对蛋白质的影响2.3.1通过蛋白凝胶电泳观察对蛋白质的影响。2.3.2（

6、纳米银颗粒在水或体液中可以释放A扩，而A扩与含琉基(一sH)的大分子有很强的结合力，可使微生物失活）将较高浓度牛血清白蛋白加入到纳米银胶体中，紫外一可见吸收光谱谱锋明显红移，且吸光度值随BSA浓度增加而下降，表明纳米银颗粒与蛋白质发生直接的相互作用2.4纳米银对呼吸链酶的影响苹果酸脱氢酶粗酶液的制备将金黄色葡萄球菌培养至对数期，按2%接种量加入到SI终浓度为0.8mg·ml-1的50ml肉汤培养基中，以不加SI组为对照，37℃，120r/min摇床中振荡培养。待培养到8、12、16、20、24、28、32、36、40h后，分别将菌悬液于6000r/min离心10m

7、in，弃上清，双蒸水洗涤3次，再用双蒸水将其分别配制成OD580为0.6的菌悬液。然后取该菌悬液各10ml，6000r/min离心10min，弃上清，用缓冲液（0.1mol·L-1Tris-Hcl，20mmol·L-1KCl，5mol·L-1MnSO4，2mmol·L-1DTT，0.1mmol·L-1EDTA，pH7.0）洗涤2次后，悬浮于10ml缓冲液中。用超声波破碎仪（破碎强度为80%）将菌体破碎，每次10S，间隔30S，循环10次，共计7min，12000r/min离心15min，除去细胞碎片，上清液即为粗酶液，于－20℃冰箱中保存，用于酶活力的测定。上述试

8、验均在冰浴