免疫荧光方法.doc

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1、（2）实验方法（1）用PBS浸洗准备好的细胞涂片3次，每次3min。（2）0.1%的TritonX-100（用PBS配制）处理涂片5-10min。（3）PBS洗净载玻片上的TritonX-100，加0.1%的牛血清白蛋白BSA溶液(用PBS配制)孵育固定好的细胞30min。（4）弃去BSA，滴加0.1%BSA稀释的一抗(1:200)，即软骨多糖诱导48hH22细胞免疫的小鼠血清，免疫湿盒中4℃过夜。同时用正常小鼠血清作对照。（5）用PBS浸洗细胞涂片3次，每次3min，以确保一抗清洗彻底。（6）避光条件下滴加BSA稀释的荧光

2、标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:200)，然后室温、暗室中孵育1.5-2h。（7）PBS洗净荧光二抗，用荧光显微镜观察。为了防止由于一抗未洗净带来的假阳性现象，实验中同时设置一组阴性对照，涂片染色操作步骤同上，把一抗换成PBS。3.4.1.1免疫荧光染色法检测抗原、抗体结合情况将H22鼠肝癌细胞制成细胞涂片，分别以空白组小鼠血清、模型组小鼠血清和免疫组小鼠血清为一抗，经荧光二抗染色后得到免疫荧光检测结果，并计算各组细胞的阳性表达率，结果如图3-1所示。  (a)       (b)                      

3、                           (c)                                                                                                                                  (d)*P<0.01vs模型组,#P<0.01 vs空白组图3-1免疫荧光染色法检测抗体生成Fig.3-1 Theimmunofluorescent staining for antibody test图3-1

4、中(a)、(b)、(c)一抗分别为空白组小鼠血清、模型组小鼠血清、免疫成功小鼠血清，(d)为免疫荧光阳性表达率。从图3-1中可以看出，一抗为空白小鼠血清的荧光极弱，一抗为模型组小鼠血清的荧光仍然不强，而一抗为治愈小鼠血清的荧光很强，阳性表达率达到了90%以上。说明免疫成功小鼠血清中存在能与肿瘤抗原结合的特异抗体，免疫小鼠的体液免疫得到增强。血清中的特异性抗体是由与其相对应的肿瘤特异抗原激活B淋巴细胞产生的。CHCP免疫成功小鼠的抗血清与H22肝癌细胞发生特异性结合，说明CHCP中含有肿瘤特异抗原，该抗原能够帮助机体识别肝癌细

5、胞并能促进机体B淋巴细胞的增殖和活化，提高机体的体液免疫能力。