特殊组织DNA的提取及鉴定.doc

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1、特殊组织DNA的提取及鉴定1、提取DNA的简易方法:1)、从全血中提取DNA：取20μl抗凝血于0.5ml无菌管中，加500μl左右的ddH2O混匀后，12000rpm离心2分钟，弃上清，（若沉淀中仍有红细胞,需重复此操作1-2次）加入样品提取液20μl,混匀,100℃煮10分钟(可在扩增仪上进行)后12000rpm离心5分钟,取上清2μl进行扩增。2)、从其它有核细胞中提取DNA：可直接加适量的样品提取液到装有发根、头屑、骨髓、精子、组织碎片等有核细胞的管中,100℃煮10分钟（可在扩增仪上进行）后12000rpm离心5分钟，取上清进行扩增。2、从全血中用有机溶剂提取DNA：1）试剂  a.

2、10%SDS  b.2.0M醋酸钠  c.20mg/ml蛋白酶K  d.苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)  e.分析纯乙醇  f.TE(10mMTris,1.0mMEDTA溶液,Ph7.5)2）步骤  A、血液样本收集于含EDTA的抽血用管子中，样品用手倒转试管混合后等分。每份700μl全血可放在1.5ml的塑料离心管中，-70℃储存。  B、在解冻的（或液体的）血液中加入800μl的TE并混匀，12000rpm离心2分钟。  C、吸取1.0ml上清液并弃去。  D、加入1.0mlTE,振荡后离心2分钟,去除尽可能多的上清液,但不要影响沉淀。  E、向沉淀中加入：375μl2M醋酸钠;25

3、μl10%SDS;5μl蛋白酶K溶液。略加振荡，于56℃保温一小时。  F、加入120μl苯酚/氯仿/异戊醇，振荡30秒。  G、12000rpm离心5分钟。  H、小心移出水相（上层）到一新的1.5ml的离心管中。  I、向水相中加入2.5倍体积预冷的分析纯乙醇，倒转试管加以混合，将试管于-20℃下放置10分钟以上。  J、12000rpm离心10分钟。  K、倾去酒精，用移液器小心吸去剩余酒精，不要触动沉淀。  L、加180μlTE后振荡。加20μl2M醋酸盐，手工混匀。  M、加500μl预冷分析纯酒精，用手轻轻混匀，12000rpm离心10分钟，倾去上清液。  N、用室温下的70%酒精

4、1ml洗涤DNA沉淀,12000rpm离心5分钟，倾去上清液。  O、用移液器吸去残余的酒精，管子置于真空离心抽除残余的酒精（大约10分钟）。或将管子放在100℃以下烘干。  P、加200μlTE于DNA沉淀中，混匀后于4℃保温过夜（或56℃溶解DNA2小时以上），次日清晨振荡10秒。3、从斑痕材料中用有机溶剂提取DNA1)试剂  a.斑痕抽提缓冲液（1.21gTris,5.84gNaCl,6.02g二硫苏糖醇，    2%SDS,10mMEDTA/升,Ph8.0）  b.其它试剂见2.1)2)步骤A、将斑痕剪成碎片后置于1.5ml的塑料离心管中。B、加400μl斑痕抽提缓冲液及10μl蛋白酶

5、K溶液，混匀，离心数秒使碎片浸入液体。C、于56℃保温过夜。D、用一新的灭菌牙签将碎片中的液体拧干后从管中取出。E、加500μl苯酚/氯仿/异戊醇，手摇混匀，12000rpm离心3钟。F、将上清液转移到新的离心管。G、上清液中加入2.5倍体积预冷的分析纯酒精。H、手摇混匀试管中的各种成分，放置-20℃10分钟以上。I、12000rpm离心10分钟。J、倾去酒精。K、用1ml室温的70%酒精洗涤。L、12000rpm离心5分钟。M、倾去酒精，用移液器吸去残余酒精。N、真空离心10分钟除去残余酒精，或在100℃以下烘干.O、56℃下用36μlTE溶解DNA，时间至少2小时。4、从精斑中分离提取DN

6、A  1）试剂  a.TNE缓冲液（1.21gTris,5.84gNaCl,0.37gEDTA/升）  b.20%sarcosyl  c.0.39M二硫苏糖醇  d.其它试剂见2.1)  2)步骤  A、从棉签上取下有检材的棉花并置于1.5ml塑料离心管中。  B、管中加入400μlTNE缓冲液；25μl20%sarcosyl;75μl水；5μl蛋白酶K溶液。手摇混匀，37保温2小时。  C、用一新的灭菌牙签将棉花拧干后从管中取出，再用12000rpm离心5分钟。  D、移上清液（内含裂解细胞或"雌性"片段）于一新的1.5ml管，不要振荡沉淀物（内含非裂解细胞或精子）。再用TNE洗脱沉淀物四次

7、。  E、在有沉淀的管中加入10μlTNE;50μl20%sacrosyl;40μlDTT;150μl水；10μl蛋白酶K溶液。手摇混匀，37℃保温2小时。  F、按3，2）E～O的方法分别抽提出两管中的雌性DNA和精子DNA。5、用Chelex从全血/血斑中抽提DNA  1）试剂  a.TE  b.5%Chelex100(w/v于无菌水中)  2）步骤  A、3μl全血或3mm×3mm的血斑置于