珠磨法提取酵母基因组.doc

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1、利用海砂提取酵母基因组1、挑GS115单菌落接种于50mL三角瓶6mLYPD培养基中，摇两瓶。将30℃，200r/min，培养过夜（16~18h）的酵母细胞分别吸取1.5mL菌液放在1.5mLEP管中，共8管，12000r/min，5min，离心收集细胞；2、用无菌水将细胞悬浮（借助10uL枪头），洗细胞，12000r/min，5min，离心；再次用无菌水洗细胞，只洗表面，去上清；3、加入200uL（0.275g）海砂，200uL裂解液，200uL酚氯仿（25:24），将细胞悬浮（借助10uL枪头），然后涡旋震荡1min，放在冰上

2、1min，重复四次；4、12000r/min，5min，离心，吸取上清液（260uL），两管合一管，共4管，每管520uL，加入等体积的酚氯仿（酚265uL，氯仿255uL），颠倒混匀，去蛋白，12000r/min，5min，离心；5、吸取上清液（500uL），加入等体积的酚氯仿（酚255uL，氯仿245uL），颠倒混匀，去蛋白，12000r/min，5min，离心；6、吸取上清液（480uL），加入等体积的酚氯仿（酚245uL，氯仿235uL），颠倒混匀，去蛋白，12000r/min，5min，离心；7、吸取上清液（460uL）

3、，加入2倍体积（920uL）的无水乙醇，放在—80℃，30min；8、12000r/min，5min，离心，去上清，加入400uL体积的70%乙醇，用手弹起沉淀，洗涤，12000r/min，5min，离心，去上清，再次加入400uL体积的70%乙醇，只洗表面，去上清，将DNA自然晾干；9、用20uL的超纯水溶解DNA，加入1uLRNaseA，37℃，消化30min；10、取5uLDNA溶液，用1%琼脂糖凝胶跑电泳。试剂配方：1、1MTris-Hcl(pH8.0)：配50mLTris碱：6.06g水：50mL用浓盐酸约2.1mL调p

4、H至8.0,2、0.5MEDTA(pH8.0)：配50mLEDTA二钠盐：9.306g水：50mL用NaOH（分子量40g/mol）约1g，调pH至8.0注意：EDTA难溶，需调到pH8.0才能溶解，溶解时超声并加热3、TE缓冲液（pH8.0）：配制500mL1MTris-Hcl(pH8.0)：5mL0.5MEDTA(pH8.0)：1mL水：494mL，调pH至8.04、提取基因组裂解液配方TritonX-100：2%SDS(W/V)：1%Nacl：100mMTris.Hcl（pH：8.0）：10mM配100mL裂解液：Trito

5、nX-100：2mLSDS：1gNacl（分子量58.44g/mol）：0.5844gTris.Hcl（pH：8.0）：1MTris.Hcl（pH：8.0）1mL