CE分离条件的优化方法ppt课件.ppt

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1、毛细管电泳分离条件选择策略概述毛细管电泳分离条件选择的内容很多，且与样品、分离模式、检测方式、进样方法乃至仪器系统结构等相关，但有许多共同之处，这里将对普遍性的问题进行考察，包括毛细管电泳模式选定、仪器操作条件确定、介质选择等。毛细管电泳模式的选定毛细管电泳有许多不同的模式，因而在分离样品前必需很好选择分离模式，以达到最佳的分离结果。毛细管电泳模式的选择，可以有不同的原则，比如简单性、目的性、普适性、选择性、样品特异性等。毛细管电泳模式的选定以简单性为原则时，所选分离模式的操作、条件优化、分离控

2、制等必需是最简单和最容易的，而且富于后续变化。根据这一道理，首先应该考虑自由溶液分离模式，最后才考虑填充形式的分离模式。简单性原则是毛细管电泳模式选择的一般规则。毛细管电泳模式的选定在分离生物样品时，通常需要根据分离的目的来选择分离模式：欲测定样品的尺寸，就须选NGCE或CGE，偶可选用CZE或MEKC；要测定样品的等电点，则应选用CIEF；在进行亲和作用研究时，则应当首先选用ACE。毛细管电泳模式的选定我们的分析目的可能并不是单一的，这时的分离模式选择，就应该注意考虑其通用性。CZE、MEKC和

3、CEC的通用性和可调节性都较大，但根据简单性原则，还以CZE或MEKC为优。注意，填充型毛细管电泳不适合于颗粒样品的分离，甚至也不适合于大分子分离。毛细管电泳模式的选定有时，我们会特别注重分离的选择性，即只希望把目标组分分离出来。此时应优先考虑选择性高的分离模式，如ACE等。如果已知样品的某些特性，也可以据此选择分离模式，比如在分离蛋白质和多肽等两性样品时，可以优先考虑CIEF；在分离中性分子时，优先考虑MEKC；在分离水难溶组分时，优先考虑非水毛细管电泳形式等。毛细管电泳模式的选定实际样品五花八

4、门，性质各异，分离模式的选择是可变的和灵活的。这种灵活性恰好与毛细管电泳模式间的易换性相吻合。基本操作条件选择这里所谓的操作条件包括：电泳电压、温度、毛细管尺寸、进样方法、检测条件等，下面分别讨论之。电泳电压理论和实验均表明，效率与电压间存在极大值。极大电压通常也是最佳工作电压。在实际分离中，如果所用的毛细管很细或缓冲液的电导很低，则极大电压可能会超出仪器的控制范围，此时没有最佳电压，可选用仪器允许的最大输出电压。当毛细管较粗或缓冲液电导较高时，极大电压有可能很小，若此时的分离度很高，也可以选择大

5、于极大值的电压进行分离。电泳电压极大电压可以利用理论计算或实验测定来获得。利用理论效率方程，通过求极值的方法可以确定极大电压。理论计算过程往往繁琐，而且也不很可靠，通过实验测定来确定工作电压其实非常简单。根据欧姆定律，电流和电压具有线性关系，如能测定电压与电流的关系曲线就不难确定工作电压。电泳电压方法如下：①在电泳条件下，改变电压（或电流）测定对应的电流（或电压）；②做电压～电流曲线；③取线性关系中的最大电压（或电流），作为分离电压（或电流）。线性以上的电压，焦耳热效应过大，一般不宜选用。但如果分

6、离效率很高，就可以选用，以便加快分离速度。在做CGE时，电场强度应控制在150～400V/cm之间，否则容易导致凝胶的破坏。电泳电压除工作电压选择外，还应考虑电压施加方式的选择。理论上，毛细电泳可有恒流、恒压、恒功率、梯度升（降）压分离等不同的工作方式。目前，绝大多数分离采用瞬间升压的恒压工作方式。实际上，采用恒流工作方式有利于提高分离的重现性，在没有良好恒温控制的系统上进行电泳时，建议采用恒流或恒功率操作。经验表明，采用升压（升流）分离，可以有效提高分离度，有条件时，应当充分考虑线性升压的工作方

7、式。在微量制备研究中，还需要考虑降压分离过程，以便于馏分的准确收集。电泳温度电泳温度的选择，主要是指毛细管外表温度的选择与控制。温度变化不仅影响分离的重现性，而且影响分离效率。温度选择应考虑：热效应控制、重现性控制、分离效率控制和分离介质对温度的限制等因素。热效应控制旨在避免管内溶液因过热而出气泡或沸腾，显然温度越低越好；重现性控制意在避免温度波动；分离效率控制的目的在于提高分离度，依据样品性质的变化而高低不等，需由实验来测定。此外，某些介质对工作温度有一定的限制，比如凝胶介质不能适应忽高忽低的温

8、度变化，也不宜在过高或过低的温度中电泳。电泳温度多数情况下，在20～30℃之间进行电泳，就能获得良好的分离结果。如若不然，便需调整或优化温度。优化多从室温开始，向上搜寻，若无结果，再向下搜寻。不少糖类样品需要高于室温的分离环境，有些样品如蛋白等则可能需要低于室温的分离条件。电泳温度毛细管电泳温度的选择，目前还受到仪器条件的限制，大多数商品仪器只能在20～50℃之间进行选择，而且不能实现温度梯度控制。此方面的研究还有待进一步展开。电聚焦当离子从高电场突然进入低电场时，会因减速而堆集在