Westernblot问题及解决办法.doc

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1、问题可能原因验证或解决办法转膜不充分膜没有完全均匀湿透使用100%methanol（甲醇）浸透膜。靶蛋白分子量小于10,000选择小孔径的膜，缩短转移时间。靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH10.5）或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液。甲醇浓度过高过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。转移时间不够Thickgel对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。背景高膜没有完全均匀湿透使用100%methanol（甲醇）浸透膜。洗膜不充分增加洗液

2、体积和洗涤次数。阻断不充分增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。二抗浓度过高降低二抗浓度。检测过程中膜干燥保证充分的反应液，避免出现干膜现象。曝光过度缩短曝光时间。抗体与阻断蛋白有交叉反应检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应。没有阳性条带抗体染色不充分增加抗体浓度，延长孵育时间。酶失活直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可

3、考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。试剂不匹配一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照物可以验证二级检测系统的有效性。一抗失效选择在有效期内的抗体；并选择现配现用的工作液。HRP抑制剂所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。有阳性条带，但条带比较弱抗体染色不充分增加抗体浓度，延长孵育时间。酶活性降低直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。标本中靶蛋白含量太低增加标本上样量。洗膜过度缩短洗涤时间。HRP抑制剂所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。抗体活性降低选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置。蛋白转移不充分

4、见上述。封闭过度减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型。曝光时间过短延长曝光时间。条带位置（大小）不对；或有非特异性条带二抗的非特异结合增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）。一抗的特异性不够使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性。蛋白降解使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂。二聚体或多聚体存在增加蛋白质变性过程及强度。抗体浓度过高降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带。蛋白上样量过大降低上样量。背景有斑点封闭剂中有聚集体使用前过滤封闭试剂。HRP耦联二抗中有聚集体过滤二抗试剂，去除聚集

5、体。膜上出现反像（暗背景上白色带）HRP含量过高降低酶联二抗的浓度。问题可能原因建议解决方法推荐电压条件下电泳时间过长电泳缓冲液过稀配制新鲜缓冲液，使用1X稀释液。推荐电压条件下电流过高，热量过大电泳缓冲液过稀配制新鲜缓冲液，使用1X稀释液。推荐电压条件下电流过低或无电流接触不良在电泳前移除胶盒底部的封条；确认缓冲液没过加样孔；检查buffercore上导线连接。蛋白带型条状（streak）上样过量样品中盐浓度过高降低蛋白上样量。通过透析或凝胶过滤降低样品中盐浓度。样品沉淀加大样品中SDS的浓度。样品中的污染，如脂类或DNA复合物离心或过滤样品以除去特定污染。制胶不佳确保灌胶均匀，一次完成

6、。条带模糊蛋白样品部分变性完全变性蛋白。蛋白样品部分还原确保加入足量的DTT或β巯基乙醇。电泳时间过长观察前面的指示剂染料，掌握恰当的电泳时间。哑铃形条带或“微笑”条带上样体积过大导致不完全堆积使用恰当的上样体积。如果样品过稀，使用超滤浓缩。电泳过程中电场不均匀如果蛋白浓度已知，上样时确保对称。分离胶表面不平在制胶时使分离胶表面水平。凝胶过期在指定的失效期前使用凝胶。