westernblot常见问题

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1、Westernblot常见问题麒盟生物Q：我的细胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，为什么呢？A:有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS浓度，同时将样品煮沸时间延长；也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。Q：我做的蛋白质分子量很小（10KD）,请问怎么做WB?A:可以选择0.2的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。Q：最后显色时用DAB好还是ECM好？A:DAB有毒，但是比较灵敏，是HRP最敏感的底物，不易保存；ECM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀值，就特别灵敏，

2、可以检测pg级蛋白，具体可以根据你实验的情况,Q：要验证某个细胞上有无该蛋白的存在，需要做免疫组化和westernblot实验吗？做这两个实验时的一抗和二抗可以共用吗？A:①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Westernblot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。②两种实验的一抗有时候不能通用公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。Q：细胞水平要做westernblot,多少细胞提的蛋白够做westernblot?A:

3、一般5x106就足够了，具体要看细胞的大小还有目标蛋白的丰度。Q：同一样品能同时提RNA又提蛋白么？这样对westernblot有无影响？A:能，没有问题。但一般情况不建议这样操作，除非样本非常珍贵，不易获取。Q：同一蛋白样品能同时进行两种因子的WesternBlot检测吗？A:当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品，只要蛋白的量足够。Q：蛋白变性后可以存放多久？A:-80°C,—两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细1消化掉（也是被酶水解了）。Q：二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后

4、，封闭液是否要作调整，能否再用5%的脱脂奶粉呢？A:不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替应该好一点。其实这种体系是很少用到的。Q：做组织样品的western的时候，怎样处理样品?A:必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性Q：免疫组化和WesternBlot可以用同一种抗体吗？A:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的

5、属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。简言之，根据具体抗体的说明来定是否可以用同一种抗体。Q：在做WesternBlot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？A:PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的,Q：检测

6、同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？A:可以。Q：蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗？A:这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12%SDS-PAGE,湿转120mA,45-60min就可以了，可以根据你实验室的经验调Q：细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？A:一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。若有特殊要求可以选择相应的蛋白酶抑制剂。Q：PVDF膜和硝酸膜结合蛋白

7、的原理是什么？A:一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢,不易脱落，结果较好。Q:westernblot内参选择什么合适？A:这与目标抗原的表达位置有关，对于胞浆和全细胞蛋白，可选择内参P-actin、GAPDH和Tubulin;线粒体蛋白则可选择内参VCDAl/Porin和COXIV;核内抗原可以选择内参LaminBl、TBP和histone。Q：不能很好地将

8、大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低？A:转移缓冲液中加入20%甲醇（终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间，•转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也能増加转