Westernblot详解及问题分析

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1、蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析张绍进WesternBlot简介WesternBlot一般流程WesternBlot常见问题分析WesternBlot简介：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印

2、迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。WesternBlot基本原理WesternBlot优点高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白WesternBlot应用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析WesternBlot流程蛋白样品的制备SDS-PAGE转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法针对水、稀盐

3、、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的提取蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。蛋白质浓度测定的各种方法汇总：http:/

4、/bbs.bbioo.com/thread-23639-1-1.html蛋白样品的变性2×SDS-PAGE上样缓冲液：DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～50μg。1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚蓝0.2g总体积100ml100mMTris-HCl(pH6.8)200mMDTT4%SDS0

5、.2%溴酚兰20%甘油ddH2OSDS：阴离子去污剂变性剂氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。蛋白质-SDS胶束的特点：（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g蛋白质结合1.4gSDS（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比不连续的电泳缓冲体系

6、。SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子结合SDS阴离子后，所

7、带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。【SDS-PAGE基本原理】凝胶成分丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵Tris-甘氨酸电泳缓冲液PAGE：聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-

8、methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：单体：丙烯酰胺（Acr）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；产物：三维网状结构凝胶聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(freeradicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redoxsystems)来完成的