RNA抽提实战经验总结.doc

《RNA抽提实战经验总结.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、改善RNA提取质量的十大要点【字体：大中小】　　　　时间：2008年8月20日0　　　　来源：生物通------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------摘要：RNAse的无处不在导致了RNA的脆弱敏感。要改善RNA提取的质量，专注RNA的Ambion公司专家为你介绍在RNA纯化过程中要特别注意的10个问题。另外还有Ambion荣誉产品超级促销信息！ABI供稿，生物通翻译1.

2、在收获组织及细胞死亡之后，应立即灭活内源的RNA酶，以防止RNA降解。   以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活：1）用含离液（如2.胍盐）的细胞裂解液收获样品，并立即匀浆。2）用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是：组织块必须保证足够小，在浸入液氮的瞬间就能冻结，以确保瞬间令RNA酶失活3）立即将样品置于RNAlater™TissueCollection:RNAStabilizationSolution中。它是一种水相、无毒的收集试剂，能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄（<0.5cm），这样RNAlater才能在RNase破坏

3、RNA之前迅速渗入组织块中。 3.使用正确的细胞或组织储存条件   在样品用液氮瞬间冻结之后，应该储存在-80°C，千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻，也会导致RNA的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉，然后置于裂解液中进行匀浆。   RNAlater使样品储存更为便利。储存在RNAlater中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达1个星期，在4°C可稳定保存长达1个月，或永久保存在-20°C。有关RNAlater的更多信息请参考. 1.彻底匀浆样品   细胞或组织的彻底匀浆对RNA提取来说，是一个很关键的步骤，它能够防止RNA的损失和

4、降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中，通过简单的涡旋震荡来匀浆；而动物组织、植物组织、酵母和细菌则常常需要更加剧烈的方法。比如说细菌的细胞壁，就需要酶消化来实现彻底的细胞裂解和RNA的最大回收。有关各种不同的样本类型，哪些方法是最适合的匀浆方法，请参考. 2.在RNA提取之前预处理样品裂解液   对于某些样品来说，在匀浆之后，RNA提取之前，还需要一些额外的处理步骤。对于脂肪含量高的组织，像脑组织和脂肪组织得到的裂解液，就需要通过氯仿抽提来去除脂类，从而提高RNA产量。许多植物组织中富含多酚和多糖，会降低RNA的质量和产量，用Plant

5、RNAIsolationAid预处理裂解液可去除这些难以处理的成分。 3.选择最好的RNA分离方法   现有众多的RNA分离方法也许令人难以取舍。目前最简单也是最安全的方法是柱式分离，如RNAqueous™或RNAqueous-4PCRKit。因为操作简单，所以这些步骤特别适用于同时处理多个样品。如果是处理复杂的组织，如富含核酸酶（胰腺）或脂肪（脑和脂肪组织）的样品，就推荐使用更加严格的、基于酚处理的RNA分离方法，如ToTALLYRNA™。更多的信息请参考。更多方法选择，请参考 4.DNase处理   如果提取的RNA将用于RT-PCR，我们推荐用DNase处理纯化的RNA样品以

6、去除残留的DNA污染。当样品来源于富含DNA的组织，如脾脏时，DNase处理也是一个好办法。Ambion的RNAqueous-4PCRKit的实验流程中包含了DNase处理的步骤，并提供了必需的试剂（DNA酶I）。DNA-free™DNasetreatment&RemovalReagents则可用于去除用各种方法制备的RNA样品中的DNA污染。这两个产品都提供了高质量的DNaseI，优化的反应缓冲液，和DNA酶消化处理后简单快速去除DNase的方法，无需使用有机溶剂和热处理。 1.减少环境RNase的暴露   为了得到完整的、高品质RNA，在整个RNA制备过程中，当RNA离开强蛋白

7、变性剂（如离液裂解液或酚）的保护时，避免引入新的RNase污染就非常关键。由于RNase几乎是无所不在，所以必须确保与纯化的RNA接触的每一样东西都是无RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作台、玻璃器皿和制胶设备，都必须用表面去污净化溶液如RNaseZap™或RNaseZapWipes来处理过。必须保证一直使用无RNase的枪头、试管和溶液，手套也应经常更换。 2.正确的沉淀   纯化得到的RNA可能需要通过沉淀来浓缩，以满足一些下游应用的需要。醋酸铵(NH4