rna抽提及反转录步骤x

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1、RNA抽提步骤准备：DEPC水配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，充分振荡使其溶解，放在1000ml容量瓶中静置过夜后备用。配成终浓度为0.1%，室温搅拌过夜，121℃高压20min，4℃密封保存。注：DEPC属于一种致癌物质，易挥发，要小心并在通风橱中操作，高压后就会分解，其毒力消失。(用来泡器械的不高压，用来配置试剂的话要高压)灭菌：匀浆器、手术器材（剪刀、镊子）铝箔包好，EP管、枪头（三种规格）、铝箔、纸121℃60（120min）min；DEPC水80℃30min。其中手术器材用于提取组织RNA。（匀浆器180°，120min）1.加Trizon裂解细胞：

2、加入适当量的Trizol至细胞中（直接加入去培养液平板中后用枪吸出，亦可细胞刮下后离心去上清再加，用量约1mlTrizol每3×106、cells）。贴壁细胞在遗弃培养基后，可以直接加入Trizol（按10cm2/1mlTrizol的比例）裂解，匀浆一定要彻底。反复吹打以打碎细胞结块，室温放置5min，使其充分裂解。（注：此时可以-80℃长期保存）2.4度，12000g×5min离心弃沉淀。萃取除杂蛋白：加入0.2体积的氯仿，立即剧烈摇动充分混匀。混匀后冰上放置15min。(注：禁用漩涡震荡器，以免基因组DNA断裂，造成基因组DNA污染)3.4℃，12000g，离心15m

3、in，此时溶液分为三层：下层的酚-氯仿，白色浑浊的中间相多为变性蛋白，水相（RNA所在相），小心吸取水相（宁可损失，也不要吸到中间相），转移至另一干净RNaseFreeEP管中；一般水相的体积为Trizol的60℅.异丙醇沉淀：向水相中加入0.5倍体积（相对于Trizol）的异丙醇，充分混匀，混匀后置于-20℃1~2h或-80℃30min，4℃，12000g，离心5-10min；（经过此步可在管底看到白色RNA沉淀）；如果起始量大的话，可以加入异丙醇即可观察到微量浑浊，则可直接离心。弃上清，RNA沉于管底。移去上清。4.75%乙醇（DEPC水配制）漂洗：加入0.5-1ml

4、75%乙醇（让75%乙醇从沉淀上缓缓流过，温和震荡离心管，悬浮沉淀，7500g5min（转速太大可能会使RNA断裂）吸去乙醇，然后用枪吸沉淀附近乙醇，再短暂离心后小心吸出剩余的液体。5.溶解RNA沉淀：用50ulDEPC水或0.5%SDS溶解RNA样品，55—60℃加热5—10min。8/81.去除二级结构：将RNA放置65℃水浴锅5min（去除二级结构）后，迅速放至冰上（防止RNA恢复原有结构）；2.测浓度、260/280,260/2303.检测RNA抽提效果：1%AgaroseGel,220V（用大电流跑迅速跑完防止RNA电泳过程中降解）,待溴酚蓝跑完全胶的三分之一时

5、，停止电泳观察结果。见下图1。4.RNA保存：-80℃可长年保存（尽量避免放置在4℃，-20℃冰箱）。MarkerD20005SrRNA18SrRNA28SrRNA图1：RNA抽提结果。亮度一般28S>18S>5S,如果5SrRNA条带过亮，则说明RNA有降解。注：电泳取样量为3μl.RNA反转录步骤1)取总RNA2μg，加入10mMdNTP，OligodT（0.5μg/μl）各1μl；2)70度加热5min，冰上放置2min；3)在同一管中加入10´Buffer2μl，RNase抑制剂1μl，反转录酶（50unit/μl）1μl。4)轻轻混匀后置于42℃，60分钟。然后

6、置80℃，5分钟。RNA2μg10mMdNTP1μLOligodT（0.5μg/μl）1μL8/8TRIZOL法抽提RNA准备：DEPC水配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，充分振荡使其溶解，放在1000ml容量瓶中静置过夜后备用。灭菌：匀浆器、手术器材（剪刀、镊子）铝箔包好，EP管、枪头（三种规格）、铝箔、纸121℃60min；DEPC水80℃30min。其中手术器材用于提取组织RNA实验步骤：1．取出储存于-80℃的组织冷冻管，置于冰浴，准备EP管并做好编号。2．取出米粒大小的组织于灭菌好的铝箔中，包好，敲碎（锤子要用灭菌的铝箔纸包好）。3．将处理好的组织转移

7、到匀浆器中，加入1ml的TRIzol溶剂（尽量将组织全部转移到匀浆器）充分匀浆至不见颗粒状物质。4．将充分匀浆好的组织液转移至编号的EP管中，加入200ul氯仿，剧烈振荡后，12000rpm离心15min。5．轻轻取出EP管，小心吸取上清液转移到新的EP管（编号），约400-600ul，注意不要吸到第一液相以下的任何物质。6．加入异丙醇500ul，置于-20℃1~2h或-80℃30min，使RNA充分沉淀。12000rpm离心7~10min。7．加入75%的乙醇（DEPC水配制）500ul，洗涤后6000rpm离心3~5min