Folin-酚试剂法测定蛋白质含量（Lowry基本法）.ppt

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1、Folin-酚试剂法测定蛋白质含量（Lowry基本法）一目的与要求掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理和方法。二实验原理Folin-酚试剂（Folin-phenolreagent）的显色原理主要是：试剂中的磷钼酸-磷钨酸混合物被蛋白质还原，形成多种还原型的混合酸，并且有特殊的蓝色。包括两步反应。㈠试剂甲使蛋白质发生烯醇化反应，在碱性条件下，形成蛋白质-铜络合物，从而使电子转移到混合酸中，大大地增强了酚试剂对蛋白质的敏感性。㈡试剂乙（磷钼酸-磷钨酸混合液）受蛋白质中半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸等作用，使钨酸、钼酸两者同时失去1个、2个或3个氧原子，还原成含有多种还原型的混合酸，并

2、且有特殊的蓝色。利用蓝色深浅与蛋白质浓度的关系，可制备标准曲线，测定样品中蛋白质含量。本法可测定的蛋白质含量为15-280g/ml。1.试剂甲1）10gNa2CO3、2gNaOH和0.25g酒石酸钾钠溶于500ml蒸馏水。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（2）0.5gCuSO4·5H2O溶于100ml蒸馏水中。　　　　　　　　　　　　　　　

3、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　每次使用前将(1)：（2)=50:1之比例混合，即为试剂甲（有效期1天）。2.试剂乙以100gNa2WO4·2H2O、25gNaMoO4·2H2O、溶于700ml蒸馏水中，并加入8.67mol/LH3PO4（85%）50ml、浓HCl100ml，混合在1.5L容积的磨口回流瓶中，接上回流冷凝管与小火回流10h。回流结束后，加

4、入150gLi2SO4·H2O、50ml蒸馏水，并随之加入一定量的液体溴，开口继续沸腾，使溶液由绿色变黄色（与回流开始前溶液颜色相似）。过量的溴可煮沸去除。冷却后，稀释至1L，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，以酚肽为指示剂，然后适当稀释（约加水1倍）,使最终的酸浓度为1mol/L。3.标准蛋白质溶液精密称取结晶牛血清白蛋白，将其溶于0.1mol/LNaOH中，使蛋白质含量为200g/mL。试剂配制：三操作步骤㈠标准曲线制作⒈取试管6支，编号。按表7-2操作，加入牛血清白蛋白标准溶液（200g/mL），补足蒸馏水，使各管容量达1mL。算出各管中实际蛋白质含量，然后

5、按顺序加入定量试剂甲、乙（各管加入乙试剂必须快速，并立即摇匀！），在分光光度计以上波长500nm比色，读取光密度。Folin-酚试剂法标准曲线制作步骤管号牛血清蛋白标准溶液/ml蒸馏水/ml各管加试剂甲2.5mL，混匀放置10min后，加入试剂乙0.25mL，立即混匀，放置10minOD50010.10.420.20.330.30.240.40.150.50600.5㈡样品测定取试管2支，分为测定管和空白管。测定管内加入0.5ml待测样品溶液（适当稀释至约25-280g/mL蛋白质）。操作步骤与制作标准曲线相同，见表。待测液ml蒸馏水ml各管加试剂甲2.5ml，混匀放置10min后，加入

6、试剂乙0.25ml，立即混匀，放置10min后比色。OD500空白管00.5测定管0.50标准管0.5（标准液）02.以各标准溶液含量为横坐标，各管的光密度为纵坐标作图，得标准曲线。(标准曲线必须从零点开始出发，最好能成一直线。画好后，注明所用仪器的型号及编号、所用波长及测定方法、名称及制作日期。)四结果与计算根据光密度读数查得标准曲线，计算检测液内的蛋白质含量。进一步可根据检测溶液的稀释倍数及实际所要求的蛋白质浓度换算。本实验要求蛋白质含量浓度以g/L为单位，也可以与测定管同样操作的标准管按下式计算蛋白质含量。测定管蛋白含量=×标准管蛋白质含量×500（稀释倍数）测定管光密度标准管光密度

7、是非题1.Folin-酚试剂测定蛋白含量的适用范围为25-280ng/mL。（×）2.Folin-酚试剂法测定蛋白质含量比双缩脲法灵敏度差。（×）3.Folin-酚试剂（Folin-phenolreagent）的显色原理涉及蛋白质的电子转移。（√）单选题1.用紫外分光光度法测蛋白质含量，选用波长为(B)(A)260nm(B)280nm(C)250nm(D)270nm2.下列哪一种蛋白质定量方法的原理直接涉及蛋白质中的肽键