等孢球虫通用探针法荧光定量PCR试剂盒说明书.doc

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1、等孢球虫通用探针法荧光定量PCR试剂盒说明书1、试剂盒简介货为了适应等孢球虫通用探针法荧光定量PCR试剂盒快速检测和疫病研究的需要，本公司参照OIE国际标准中规定的引物序列，经多次实验及系统优化，开发生产了本试剂盒。应用本试剂盒进行检测具有快速、灵敏、特异、准确、安全操作简单、应用广泛和高通量检测等特点及优点。2、试剂盒组成:试剂盒组成包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂，具体组成参见表1：表1：试剂盒组成（50test/盒）组成成分体积样品DNA提取液1样品DNA提取液25ml×1管500µl×1管核酸扩增试剂：DEPC水BPPCR反应液Taq酶(5U/ul)阴性对照BP阳性对照5ml×1管

2、750µl×1管40µl×1管1ml×1管1ml×1管*保存条件：样品DNA提取液1、2和试剂盒须在-20℃保存。3、样本采集，存放及运输3.1样本采集所用取样器材必须经过高压灭菌并烘干。取对虾的腮丝、肝胰腺、腹肢等组织各30mg标记后置于离心管中，按照试剂盒配套的DNA抽提试剂盒操作说明提取DNA模板。3.2存放研磨后的样本应尽快提取DNA；待测样本应避免冻融。3.3运输采用或泡沫箱加冰密封进行运输。4、检测步骤4.1.1DNA核酸提取操作方法(在样本处理区进行)：取n个1.5ml灭菌Eppendorf管，其中n为待检样品数和一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。(注：试剂盒中的阳性

3、对照直接作为PCR检测的模板，无需提取核酸)4.1.2每管加入100µlDNA提取液1，然后分别加入待测样本和阴性对照各100µl，一份样本换用一个吸头；混匀器上震荡混匀5s,于4℃～25℃条件下，12000r/min离心10min。4.1.1尽可能吸弃上清且不碰沉淀，再加入10µlDNA提取液2，混匀器上震荡混匀5s,于4℃～25℃条件下，2000r/min离心10s。4.1.2100℃干浴或沸水浴10min；加入90µlDEPC水，12000r/min离心10min，吸取上清，即为提取的DNA，冰上保存待用（提取的DNA需在2h内进行PCR扩增或放置于-70℃冰箱内保存）。4.2PC

4、R检测4.2.1扩增试剂准备（在反应混合物配制区进行）：从试剂盒中取出相应的PCR反应液、Taq酶，2000×g离心5秒钟。每个样品测试反应体系配制见下表2。表2每个样品测试反应体系配制表试剂PCR反应液Taq酶合计用量14.5μL0.5μL15μL4.2.2加样（样本处理区进行）：向每个PCR管孔中各分装15μL的混合液，再分别加入样本DNA模板10μL，盖紧管盖，500r/min离心30s。4.2.3PCR检测（在检测区进行）：阶段，95℃/3min；第二阶段，94℃/30sec，60℃/30sec；72℃/1min；35个循环；第三阶段，72℃/7min；第四阶段，4℃保存4.3琼

5、脂糖电泳用电泳缓冲液制备1.5%的琼脂糖凝胶平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好没过胶面，向PCR扩增产物中加入1/6体积的电泳上样缓冲液（6X上样缓冲液），按比例混匀后加入样品孔。在电泳时设立DNADL2000Marker做对照。5V/cm电泳约0.5h，当溴酚蓝到达一定位置时停止。在紫外灯下或凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍摄并记录。5、结果判定5.1PCR后，阳性对照会出现一条196bp的DN段。阴性对照和空白对照没有该核酸带。5.2待测样品PCR扩增后能在相应196bpDNA位置上有带，可判为BP核酸阳性。6、相关技术信息F:5’-GAT

6、-CTG-CAA-GAG-GAC-AAA-CC-3’R:5’-TAC-CCT-GCA-TTC-CTT-GTC-GC-3’