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《高中生物专题5DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离课件新人教版.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、目标导航预习导引目标导航预习导引一二一、分离蛋白质的原理与方法1.分离蛋白质的原理2.分离蛋白质的方法(1)凝胶色谱法①概念:根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法,也叫分配色谱法。目标导航预习导引一二②过程及原理b.分离的过程目标导航预习导引一二c.分离原理:依据相对分子质量的不同而将蛋白质分离。(2)电泳法①电泳的概念:指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。②原理:利用了待分离样品中各种分子的带电性质的差异、分子本身的大小以及形状的不同,使带电分子在电场中产生不同的迁移速度,从而分离样品中的各种分子。③分离方法:琼脂糖凝
2、胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中后者使用时通常加入带负电荷多的SDS,形成“蛋白质-SDS复合物”,使蛋白质迁移速率仅取决于分子的大小。3.缓冲溶液(1)组成:通常由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例,可配制不同pH的缓冲液。(2)作用:抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变。目标导航预习导引一二缓冲溶液中含对酸碱起缓冲作用的缓冲对,每一缓冲对均由弱酸和相应的强碱盐组成。细胞外液也有酸碱缓冲对,你能回忆并说出细胞外液中的酸碱缓冲对吗?提示：细胞外液中主要的酸碱缓冲对有:H2CO3/NaHCO3、N
3、aH2PO4/Na2HPO4等。目标导航预习导引一二二、凝胶色谱法的实验操作1.蛋白质的提取和分离步骤(1)样品处理血红蛋白的释放:红细胞在蒸馏水和甲苯作用下破裂,释放出血红蛋白分离血红蛋白溶液:混合液离心→过滤去除脂溶性沉淀层→用分液漏斗分离目标导航预习导引一二(3)纯化:凝胶色谱法。(4)纯度鉴定:SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。目标导航预习导引一二2.凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作。(2)凝胶色谱柱的装填。固定:将色谱柱垂直固定在支架上↓装填:将用蒸馏水充分溶胀后的凝胶配成凝胶悬浮液,一次性缓慢倒入色谱柱内,装填时可轻轻敲动
4、色谱柱,使凝胶装填均匀↓洗脱:装填完后,立即用缓冲液洗脱瓶,在约50cm高的操作压下,用300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)充分洗涤平衡凝胶12h目标导航预习导引一二(3)样品的加入与洗脱。①加样前:打开下端的流出口,使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,关闭出口。②加透析样品。调整缓冲液面:与凝胶面平齐↓滴加透析样品:用吸管将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端↓样品渗入凝胶床:加样后,打开下端出口,等样品完全进入凝胶层后,关闭下端出口↓洗脱:打开下端出口,用20mmol/L的磷酸缓冲液洗
5、脱目标导航预习导引一二↓收集:待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,用试管收集流出液,每5mL收集一管,连续收集3.操作提示(1)红细胞的洗涤:洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少,无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀,达不到分离效果。(2)色谱柱填料的处理:商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀,可以将加入其中的湿凝胶用沸水浴加热,加速膨胀。(3)凝胶色谱柱的装填:在装填凝胶柱时,不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。(4)蛋白质的分离:如果红色区带均匀一致地移动,说明色
6、谱柱制作成功。目标导航预习导引一二(1)凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱都装填有不能通过“柱”下端多孔板(或多孔筛板)的颗粒,它们的颗粒功能有何不同?提示：凝胶色谱柱装填的是凝胶颗粒,允许小分子进入,不允许大分子进入,通过延长小分子的路程使大分子与小分子分离。固定化酶的反应柱装填的是固定有酶的载体颗粒,既能催化反应物的反应,又保证了酶与反应物分子的分离,实现了酶的重复利用,节约了生产成本。(2)凝胶色谱柱和固定化酶的反应柱都能进行化学反应吗?提示：不是。固定化酶的反应柱能进行化学反应,凝胶色谱柱不能进行化学反应。知识精要典题例解迁移应
7、用知识架构一二一、血红蛋白提取和分离的原理1.分离不同种类蛋白质的原理蛋白质的理化性质(如形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等)千差万别,由此可提取和分离各种蛋白质。2.凝胶色谱法(分配色谱法)(1)凝胶:实际上是一些微小的多孔球体,大多数是由多糖类化合物构成的,如葡聚糖、琼脂糖。(2)原理:凝胶小球体内部有许多贯穿的通道,相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,只能分布在颗粒之间,通过的路程较短,移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道,通过的路程较长,移动速度较慢,因此可将
8、各种相对分子质量不同的蛋白质分子分离。知识精要典题例解迁移应用知识架构一二(3)分离过程:混合物上柱→洗脱→大分子蛋白质流动快、小分子蛋白质流动慢→收集大分子→收集小分子。3.缓冲溶液(1)原理:由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成(如H2CO3/NaHC
