应用生物化学蛋白质组学DEppt课件.ppt

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1、蛋白质组学-双向电泳(Proteomics-2DE)化学与生命科学学院OneGenome–ManyProteomesOneGenome–ManyProteomes卵毛蚴母胞蚴子胞蚴成虫童虫尾蚴（人、牛、鼠等）（钉螺）（钉螺）CentraldogmaDNARNA蛋白质复制转录逆转录复制翻译中心法则基因表达调控FromGenestoProteinsSequencedatabasesWhatcouldhappen+GeneExpressiondatabasesWhatwouldhappenProteinExpressiondataba

2、ses+Whatishappening蛋白质组(proteome)是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合,意指proteinsexpressedbyagenome，即“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。1.Concept在人类基因组计划中大约有30,000个基因被鉴定出来。一个基因=平均4个左右的剪接变异体，约120,000或更多的独立蛋白。+翻译后修饰和蛋白相互作用，蛋白质组比基因组复杂10倍以上。1.ConceptPro

3、teomics指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞或组织内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得2.双向电泳的实验原理双向电泳在第一向分离中蛋白质先按其等电点分开

4、（isoelectricpointpI值）。pI值就是使蛋白质不带净电荷，且在电场中不发生迁移的特定pH值。这项将蛋白质按其等电点分离的技术称为等电聚焦（IEF）。2.双向电泳的实验原理双向电泳的第二向电泳是在第一向垂直方向上进行SDS-PAGE分离。+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10第一向：等电聚焦+–pH3pH7.5pH10–pH3pH7.5pH10chargesize第二向：SDS-PAGE电泳pIM.Wt.2-DElectrophoresisP

5、H3PH10IntuitiveSpotDetectionWizard差别分析示意图Sample1aSample1bSample1cPresentin(a)and(c)not(b)Presentonlyin(a)Strongerin(b)than(a)or(c)FirstDimensionIEFSecondDimensionSDS-PAGEGelStainingSpotExcisionImagingandAnalysis双向电泳流程SamplePreparationExcision/digestionDigestionProtoc

6、olDe-stain50mMammoniumbicarbonate/50%acetonitrileReduce10mMdithiothreitolin100mMammoniumbicarbonate,30minutesAlkylate55mMiodoacetamidein100mMammoniumbicarbonate,20minutesWash100mMammontiumbicarbonate（重碳酸铵）DehydrateAcetonitrile（乙晴）Digest6ng/uLTrypsinin50mMammoniumbica

7、rbonate(25uL),5hoursat37°C全自动蛋白切取仪Massspectrometry50007500100001250015000025507510002550751000255075100025507510002550751000255075100500075001000012500ControlControlControlTreated15000TreatedTreatedMALDI-TOF-MSARoadMaptoDiscovery肽指纹图谱搜库AWPSGSAWPGYFRB11MAERRVPFTFLTSPS

8、WEPFRDWYHGSRLFDQSFGMPHIPEDWYKWPSGSAWPGYFRLLPS61ESALLPAPGSPYGRALSELSSGISEIRQSADSWKVTLDVNHFAPEELVVKTKDNIVEITG121KHEEKQDEHGFISRCFTRKYT