蛋白质组学课件.ppt

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1、蛋白质组学及其相关技术研究概况一、蛋白质组学产生背景二、蛋白质组学的研究内容三、蛋白质组学研究的相关技术四、蛋白质组学研究的应用五、蛋白质组学研究中的困难一、产生背景1.20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。2.随着人类基因组全序列测定，生命科学跨入了后基因组时代。3.因mRNA的表达情况不能直接反应蛋白质的表达水平。4.蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获知。蛋白质构象病更难于只靠DNA序列来解释。5.蛋白质才能动态反映生物系统所处的状态。20世纪

2、90年代中期，国际上萌发了蛋白质组学。6.蛋白质组与蛋白质组学（1）蛋白质组：1994年提出，最早见于文献是1995年7月的“Electrophoresis”杂志上。指基因组表达的所有相应的蛋白质，也可说是指细胞或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。（2）蛋白质组学：研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的科学。7.蛋白质组具有多样性和可变性的特点（1）蛋白质的种类和数量在同一机体的不同细胞中是各不相同的。（2）同一细胞，在不同时期、不同条件下，蛋白质组也是在不断改变的。（3）在病理或治疗过程中，细胞蛋白质的组成及其变化与正常生

3、理过程的也不同。二、蛋白质组学的研究内容细胞或组织内蛋白质的表达模式及修饰（表达蛋白质组学）：关键技术：2-D电泳2.蛋白质的序列和高级结构（结构蛋白质组学）：X-射线单晶衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。3.蛋白质的胞内分布及移位（细胞图谱蛋白质组学）：确定蛋白质在亚细胞结构中的位置，通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等。4.蛋白质的功能模式（功能蛋白质组学）：蛋白质与蛋白质及其与其他分子的相互作用三、蛋白质组研究的相关技术（一）研究细胞或组织内蛋白质表达模式的技术

4、：2-D电泳1.1975年，PatrickOˊFarrel发明了二维凝胶电泳。2.操作（1）等电聚焦（2）平衡胶条（3）第二相SDS-PAGE3.2-D胶上蛋白质鉴定（1）早期Westernblot鉴定（2）Edman降解法鉴定（3）肽质量指纹（peptide-massfingerprinting）技术鉴定（4）蛋白质组信息学2D電泳→ Mass定序分析（二）构象解析技术1.实际测定具体蛋白质的三维结构：X-射线单晶衍射分析（晶体结构分析）、多维核磁共振波谱分析、电镜二维晶体三维重构术（电子晶体学）。X-射线单晶衍射分析：最成

5、熟和最有力的方法。（1）局限性（2）改进措施：已经运用原子力显微镜及多功能光学诊断技术深入研究蛋白质晶体生长的机理；高能量光源的使用。2.通过氨基酸序列知识去辨识和推引出其决定的三维结构（1）用分子力学、分子动力学的方法，根据理化的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。（2）通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新蛋白质空间结构的预测。（三）蛋白质序列测定1.蛋白质直接测序的用途2.肽序列分析的基本步骤：（1）分析已纯化蛋白质氨基酸残基的组成。（2）测定头尾氨基酸。（3）把肽链

6、水解成片段，分别进行分析，得到肽图。（4）Edman降解蛋白质测序发展简史1.英国科学家Sanger测序（20世纪50年代）。2.建立色谱技术和定量氨基酸分析技术（20世纪50年代）。3.Edman降解（20世纪70年代出现）。仪器自动化：液相自动测序仪和固相蛋白质自动测序仪。进入20世纪80年代，气相测序技术出现并实现了仪器自动化。灵敏度显著提高，样品量只需10pmol以下，一次连续测定的顺序甚至可超过80个残基。样品处理远比固相方法简单和操作方便。4.20世纪70年代，华裔学者张瑞耀提出的有色Edman试剂——DABITC

7、，使手工测序技术更加灵敏可靠。5.对2-D胶上的点进行测序：将蛋白质转印到PVDF（聚偏二氟乙烯）膜上，然后将膜片放入测序仪的反应室中进行Edman降解。6.毛细管电泳技术（20世纪90年代发展起来的微量分析技术）的采用，是蛋白质N端微量顺序测定方法学一个引人注目的发展。其灵敏度比HPLC高两个数量级。可在10fmol的水平检测氨基酸。微型测序仪与毛细管电泳联用的微量蛋白质测序方法已经呈现很好的前景。7.蛋白质C端测序：C端测序的重要性：为PCR扩增出某一蛋白的完整基因提供合成C端引物的重要依据；以及为基因表达的蛋白质的鉴定提

8、供关键的证据等。（1）最成功的方法是在Schlack早年提出的异硫氰酸法的基础上发展起来的。（2）直到20世纪90年代初由于发展出一些新的偶联和裂解试剂，配合用HPLC对乙酰内硫脲氨基酸（TH）的鉴定，该方法才得以较快地发展。目前已有自动化C端测序仪，能常规地进行6-8个残基