蛋白质组学的相关技术及应用课件.ppt

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1、蛋白质组学(proteomics)的相关技术及应用蔡灿陈蕾陈磊磊李振蛋白质组学蛋白质组学的含义蛋白质组(Proteome):最早由澳大利亚学者Wikins等于1994年提出,指的是由一个基因组或一个细胞、组织表达的所有protein。蛋白质组是一个动态的概念。蛋白质组学(proteomics):则是研究特定时间或特定条件下这些蛋白质表达情况的科学，其内容包括蛋白质的定性鉴定、定量检测、细胞内定位、相互作用研究等。其目的在于归类细胞中的蛋白质的整体分布，鉴定并分析感兴趣的个别蛋白，最终阐明它们的关系与功能。是基因组ＤＮＡ序列与基因功能之间

2、的桥梁。蛋白质组学与基因组学蛋白质组学种类蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质组流程图蛋白质组学研究的相关技术双向电泳技术双向电泳(TwoDimensionalElectrophoresis，2DE)是蛋白质组研究的三大关键核心技术之一，由Farrel等人于1975年建立。它是利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异，通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质组的技术。双向电泳技术能同时将上千种蛋白质同时分离和展示,也是目前分析复杂组份蛋白质分辨率最高的工具。1基本原理第一向：pH梯度等电聚焦,因为蛋白质是两性分子,具有不同的等电点,在pH梯度介质中外加电

3、场作用形成分离的蛋白质区带。IEF时，在电场的作用下，蛋白质将移向其静电荷为零的点，静电荷为正的蛋白将移向负极，静电荷为负的将移向正极，直到达到等电点，这就是IEF的聚焦效应。第二向：根据分子量不同进行分离，此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS是一种阴离子去污剂，它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电，所带电荷与蛋白质的分子量成正比，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。2DE基本原理图示2双向电泳的技术方法2DE基本流程图蛋白样品制备样品制备主要包括溶解、变性、还原等步骤,以充分破坏蛋白

4、质之间的相互作用,并同时除去其中的非蛋白质组分如核酸等。(1)细胞培养、处理和收集；(2)将细胞在IEF裂解缓冲液中溶解(3)将样品离心以去除不溶的细胞碎片和DNA，提取上清，-80℃保存。样品制备原则不同的样品处理方法Dnase、RnaseA来降解核酸二次样品制备双向电泳的技术图等点聚焦（IEF）IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。根据建立pH梯度原理不同分为：载体两性电解质pH梯度和固相pH梯度。前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度，后者是将缓冲基团作为凝胶介质的一部分根据电泳方式不同分为：

5、管状、薄层、垂直和水平等电聚焦。根据支持介质的不同：①ISO–DALT：在聚丙烯酰胺凝胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度。②IPG–DALT：使用丙烯酰胺和固相化的两性电解质共聚,可形成具有pH梯度的凝胶，是现在主要和常用的方法。③非平衡pH梯度电泳蛋白质分子的电聚焦过程+pI1pI2pH=pIpI3pIn-abc蛋白质分子在负极端蛋白质分子在正极端蛋白质样品中各组分聚焦成区带—+等点聚焦（IEF）IPG胶条平衡SDS-PAGESDS–PAGE：利用蛋白質分子量大小的不同，使其在电泳中分离。第二向SDS-PAGE在恒温下进行,

6、一般采用1.5～1mm厚的聚丙烯酰胺凝胶,进行5～8小时左右。起始时用低电流或低电压,样品在完全走出一向胶条时,再加大电流(或电压),待指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。SDS-PAGE染色银染法：灵敏度高，可以在电泳图中找到含量较低的蛋白，所需的上样量较少（每点仅需0.1ng），可以检测到小于1ng的蛋白点，但线性范围小于2个最高数量级。对温度依赖性大，而且需要精确控时的操作考马斯亮兰：灵敏度较低，检测限度约为每点10ng蛋白，但可以染色多种蛋白质，并能与蛋白量呈两个最高数量级的线性关系。荧光染色法：一种终点染色方法，可以检测到大约1

7、ng的蛋白点。荧光染色法与蛋白量呈3个最高数量级的线性关系，需用荧光扫描仪显示用荧光染色法染色的蛋白点。图像分析及数据处理大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片将染色后的凝胶放在GS-710光密度扫描仪上，扫描后的图像用PDQUEST2D软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑点进行比较。应用双向电泳技术在蛋白质组学中发挥着重要的作用,可用于研究样品总蛋白、不同样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作用、蛋白质修饰等。2-DE凝胶图谱斑点是以计算机为基础的图像分析软件,包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建等在内的图像分析,将凝胶上的斑点数

8、字化,根据标准蛋白即可以获得关于被检测蛋白其等电点和分子量的信息,从而用于建立数据库。2-DE技术还广泛应用于医学领域的研究工作,如通过斑点对比,寻找差异蛋白,从而发现疾病相关蛋白,寻找用于诊断的疾病相关标