流式细胞术在出血与血栓性疾病中的应用ppt课件.ppt

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1、流式细胞术（flowcytometer，FCM）在出血与血栓性疾病中的应用安徽省立医院血液科吴竞生FCM在出血与血栓性疾病中的应用集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学及单克隆抗体为一体的新技术。对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速、灵敏、多参数定量分析和分选技术。开创了对单个BPC或亚群分析的新途径。2FCM分析BPC的主要项目血小板计数：CD41、CD61射门网织血小板（RNA噻唑橙黄染料）：含RNA的BPC自身抗体:特异性血小板抗体、PAIg、同种抗体免疫表型分析：膜糖蛋白表达:GPIb/IX/V复合物(CD42a、CD42b

2、、CD42c、CD42d))GPIIb/IIIa复合物（CD41、CD61）FV、IIIaBPC活化：膜糖蛋白表达（P-选择素，CD62p）BPC内物质，微粒对不同刺激剂的反应性：胞质钙流3FCM在出血性疾病中的应用1、血小板减少：血小板数量、网织血小板2、血小板功能缺陷血小板无力症：GPIIb-IIIa（CD41-CD61）巨大血小板综合征：GPIb-IX（CD42b-D42a3、血小板抗体：血小板相关免疫球蛋白（PAIg）血小板糖蛋白特异性自身抗体（GP）4、血小板采集、储存与输注的监测.4出血性疾病的分类血管壁功能异常遗传性（毛细血管扩张症、家族单

3、纯性）获得性（过敏性紫癜、血管炎、免疫性）数量遗传性、获得性Aa、巨核、免疫性、ITP、DIC血小板异常数量（ET，CML）功能异常（GT、BS、颗粒性）凝血功能障碍遗传性（血友病、VWD、其他凝血因子缺乏）获得性（VK缺乏，肝脏病，DIC、药物）循环中病理性抗凝物质凝血因子抑制物肝素样抗凝物质；狼疮样抗凝物纤维蛋白（原）溶解亢进遗传（t-PA/u-PA↑抗纤溶酶）获得（DIC，血栓症）血小板计数BPC直径1-4m，与RBC，WBC或碎片、免疫复合物大小相等，影响计数准确性。FCM优点：利用各种BPC特异性单克隆抗体→直接标记荧光素分子快速、准

4、确，排除非BPC颗粒干扰，误差<5%，尤其适合BPC＜20X109/L重复性好缺点：技术条件要求高，费用高。6FCM分析血小板原理利用荧光素标记的BPC特异性单抗或与待测成分特异性结合且能发荧光的物质+分离BPC或全血→去除未反应的单抗或荧光物质;→特异检测5000-10000BPC光散射与荧光信号（单色或多色）;→获取,统计数据,分析,→根据光散射与荧光强弱→计算阳性BPC百分比或所测成分的含量（GP/BPC).7FCM分析血小板方法抗凝血2ul调节BPC105-106/ml2-80C预冷的1%多聚甲醛1ml固定，2hBPC特异单抗+荧光剂(异硫

5、氰酸荧光素)(CD42bFITC)+SSC+FSC设门-特异性选择BPC.检测10000-100000BPC表面荧光信号.FCM获取，分析数据结果表示:平均颗粒荧光强度-活化时GP:Ag量特异性荧光抗体结合阳性BPC%-x.8血小板光散射图9FCM分析血小板的客观评价利用各种BPC特异性单克隆抗体→直接标记荧光素分子优点：1、接近生理条件直接测定血小板:2、微量（2ul)3、快速、准确，排除非BPC颗粒干扰，误差<5%，主观因素少灵敏度高、尤其适合BPC＜20X109/L、重复性好4、克服BPC小；环境影响（血管壁、剪切力、刺激剂→变形、黏附、聚集、

6、释放、血小板活化与反应性不足：1、技术要求高,费用高。2、不能反映与血管壁相互作用，10血小板功能缺陷黏附异常巨大血小板综合征GP1b-FX血管性血友病（vWD）vWF量、质异常血小板型vWDGPIIb-FIX自发结合vWF聚集异常血小板无力症GPIIb-IIIa缺乏颗粒异常灰色血小板综合症颗粒储存异常或成分缺乏储存池病、致密体颗粒缺乏受体与信号传递异常环氧化酶缺乏症环氧化酶缺乏合成酶缺乏症合成酶缺乏信号传导缺陷症花生四烯酸不能动员膜磷脂异常11121314血小板膜糖蛋白分析GP受体是血小板功能基础，分子结构或数量异常，可导致出血或血栓。GPIIb

7、/IIIa复合物(CD41/CD61)GPIb/IX/V复合物(CD42a/CD42d)GPIa/IIa复合物(CD49b/CD29)GPIc/IIa复合物(CD49e/CD49f/CD29)GPIV(CD36)2种单抗双色FCM：一种单抗为血小板标志性抗体设定阈值（鉴别血小板）；一种为检测抗体。15FCM分析血小板膜糖蛋白荧光标记的抗BPC糖蛋白抗体(McAb)+GP特异性结合FCM上测定结合荧光素的阳性BPC%与强度。直接法或标记二抗间接法.优点：灵敏度高:可测BPC上微弱荧光强度。特异性强:FS+SS与其他细胞、碎片区分准确度高:数万BPC表示

8、结果:%+强度操作:简单，快速。16双色荧光分析血小板膜糖蛋白17血小板分化抗原