第五章基因工程的操作过程ppt课件.ppt

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1、第四章基因工程的操作过程一、DNA的体外重组二、重组DNA导入宿主细胞三、转化子的筛选基因工程操作过程一、DNA的体外重组（切与接）1、同种内切酶产生的粘性末端的连接2、同尾酶产生的粘性末端的连接3、不同粘性末端的连接4、不同限制性内切酶的双酶切反应5、重组率5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'5'GCTTAA5'5'AATTCG5'退火GCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGGCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGT4-DNA

2、ligaseGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAG1、同种内切酶生产的粘性末端的连接极性有两种可能！2、同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'TACTAG5'5'GATCAT5'退火GCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT5'TGATCAACTAGT5'BgllIG

3、CCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT同尾酶连接后，不能用任何一种酶切，称为焊死！3、不同粘性末端的连接BamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'CTGCAG5'GACGTC3'T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC5'CTGCAGGACGTC5'PstI3'T4-DNApol切平5'CG5'GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'

4、CTAGGCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC4、粘性末端的更换BamHI5'5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseKlenow补平GATCC5'G5'GCCTAG5'5'5'GGATCCCTAG5'GATCCCTAGG5'5'GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'5'EcoRIGGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker5、双酶切反应1、同步双酶切能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体

5、活性相应调整酶量和反应时间。2、分步酶切没有可以同时适合两种酶的缓冲液，从要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。6、重组率1）重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%，它是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。2）提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：3:1-10:1载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCT

6、TAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'p5'GCTTAAOH5'5'AATTCG5'HO退火5'G-A-A-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸酶碱性磷酸酶二重组DNA分子导入宿主细胞1、宿主细胞种类原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞2、主要方式转化（transformation）转染（transfection）电穿孔（electroparation）3、大肠杆菌的转化（transformat

7、ion）将重组DNA分子引入感受态细菌（competentcell）,使其在细菌内扩增及表达的过程，1970年建立此技术。感受态细菌：Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，利于外源DNA吸收，细菌细胞此时的状态叫做感受态。CaCl2转化的原理：当细菌处于0℃、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，细胞膜通透性增加，处于感受态；此时重组DNA与Ca2+形成羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42℃短时间热冲击后进入细胞，在培养基中生

8、长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖，转化效率为105~106个细胞/ug。转化过程：受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养2