基因工程的操作过程

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1、4基因工程的操作过程C转化子的筛选和鉴定（检）B重组DNA分子的转化和扩增（转、增）ADNA的体外重组（切、接）4基因工程的操作过程切接转增检ADNA的体外重组（切与接）4基因工程的操作过程同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接重组率同种内切酶生产的粘性末端的连接5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'5'GCTTAA5'5'AATTCG5'退火GCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGGCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTC

2、GT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAG同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'TACTAG5'5'GATCAT5'退火GCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT5'TGATCAACTAGT5'BclIGCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATC

3、ATTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT重组率重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。重组率提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'p5'GCTTAAOH5'5'AATTCG5'HO退火5'G-A-A-T-

4、T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶B重组DNA分子的转化和扩增（转与增）4基因工程的操作过程转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细

5、胞的制备：100ml菌体培养至OD600=0.5，离心收集菌体用10ml冰冷的20mMCaCl2溶液悬浮菌体，离心用1ml冰冷的100mMCaCl2溶液悬浮菌体冰浴放置12-24小时，备用收集菌体转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100ml感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组冰浴放置半小时在42℃保温2分钟（热脉冲）快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟DNA连接液，混匀加入1ml新鲜培养基，于37℃培养1小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选转化的原理与技术细菌原生质

6、体的转化革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化转化的原理与技术电穿孔转化将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验转化率转化率的定

7、义转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）转化率转化率的定义例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才

8、有一个分子进入受体细胞另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA转化率转化率的用途利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如