《基因工程操作过程》PPT课件

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1、第四节基因工程操作过程一、DNA的体外重组（切、接）二、重组DNA分子的转化和扩增（转、增）三、转化子的筛选和鉴定（检）转基因技术一DNA的体外重组（切、接）粘性末端连接和5‘端去磷酸化利用衔接物进行平末端的连接3’5’粘末端平端化的连接同聚物接尾法二DNA分子的转化和扩增（转、增）转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增转化的原理与技术■Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态

2、。基因工程菌HB101,JM109转化(transformation)制备感受态细胞冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态感染(infaction)转导(transduction)：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100ml感受态细胞，加入相当于50ng载体的重组DNA连接液，混匀冰浴放置半小时在42℃保温2分钟（热激）快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟加入1ml新鲜培养基，于37℃培养1小时（扩增）涂在合适的固体培

3、养基平板上进行筛选转化率转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。转化率的影响因素：载体及DNA重组分子受体细胞转化方法转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时原生质体转化后的再生过程噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作转化

4、细胞的扩增扩增操作的目的增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选表达外源基因，便于筛选和鉴定三转化子的筛选和鉴定（检）遗传学方法插入灭活法(insertioninactivation):抗药性标志选择标志补救表达产物与营养缺陷互补α-互补蓝白斑筛选免疫学方法分子杂交原位杂交PCR限制性酶切图谱pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板抗药性筛选法显色筛选法将外源基因克隆在pUC18的lacZ’标记基因内部，使之插入失活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄（白）色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落lac

5、Z'oriAp+X-gal重组子（Apr+lacZ-）AppUC18菌落噬菌斑原位杂交法菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。聚丙烯酰胺凝胶电泳法如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选DNA序列分析法DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异

6、性终止测定DNA序列。作业：简述基因工程基本原理。简述基因克隆的主要方法。