酶工程实验报告四(纤维素酶酶促反应初速度的测定).doc

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1、本科学生实验报告仅供参考责任自负学号姓名孙永升学院生命科学学院专业、班级10生物技术实验课程名称酶工程<实验>教师及职称李俊俊<讲师>开课学期2012至2013学年第二学期填报时间2013年5月8日云南师范大学教务处编印实验名称实验方式小组成员实验四：纤维素酶酶促反应初速度的测定小组合作XXXXXXXX1、实验目的求出在一定条件下测定酶活力的初速度时间范围，并了解它的意义，了解浓度度对曲线的影响。2、实验仪器、试剂和溶液：2.1仪器：紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅、试管架（1个）、l移

2、液管、洗耳球、标签（若干）、分析天平（感量0.01mg）等。2.2试剂和溶液2.2.1柠檬酸钠缓冲液，0.05mol/L，pH4.82.2.210mg/ml的CMC-Na溶液（底物溶液）2.2.3DNS试剂（CMCA-DNS）2.2.4纤维素酶液3、实验原理或装置示意图：原理:产物生成量与时间的关系曲线称为酶反应的进程曲线。曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延续，反应速度逐渐降低。这是由于：底物浓度的降低，产物浓度的增加加速了逆反应进行；产物的抑制作用

3、，产物的积累导致pH改变；酶会部分失活。因此，为了准确表示酶的反应速度就必须采用初速度维持恒定的速度。在酶活力测定时，一般应先做进程曲线，然后再求出代表初速度的反应时间范围。本实验采用最适pH、最适温度和足够高的底物浓度，来测定不同酶浓度下反应速度的时间范围。4、实验方法步骤、操作流程及注意事项：4.1实验方法与步骤：1、酶液制备精确称取固体纤维素酶0.05g、0.1g、0.15g、0.2g，分别溶于100mL蒸馏水中，制成浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL的酶液

4、。2、预热(1)分别取50mL的底物溶液和不同浓度的已制备好的纤维素酶酶液于250mL三角瓶中，在50℃水浴中保温10min。（2）将保温后的酶液迅速倒入保温后的底物溶液中，振荡混匀，并立即用秒表计时，在50℃水浴中继续保温。3、测定步骤（1）保温时间：3min、6min、9min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min。（2）保温到不同的时间时，迅速取2mL反应液于装有3mLDNS试剂的25mL试管中（取两次，每次时间间隔相同），迅速振荡均

5、匀。（3）将两支试管沸水浴5min，自来水冷却后，加蒸馏水20mL。摇匀，在540nm处读取OD值。（4）空白管：在25mL试管中依次加入1mL底物溶液、3mLDNS、1mL对应浓度的酶溶液。（注意：每次加入溶液时均需充分混合均匀）注意：原酶液的稀释对于测定反应初速度进程曲线很关键，四种酶液稀释浓度的OD值控制在0—1之间。本实验在纤维素酶最适反应条件50℃、pH4.8下测定不同浓度下纤维素酶反应初速度值。4.2操作流程：A制备不同浓度酶液↓B预热↙↘50mL的底物溶液纤维素酶酶液于250mL三角

6、瓶中↓C50℃水浴中保温10min↓D保温后底物与酶液反应将酶液迅速倒入底物溶液振荡混匀，立即用秒表计时于50℃水浴中继续保温↓E不同时间保温3min、6min、9min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min。迅速取2mL反应液于装有3mLDNS试剂的25mL试管中（取两次，每次时间间隔相同），迅速振荡均匀保温不同时间：↓F测定↙↙↘↘①反应终止→②沸水浴5min→③定容至25ml→④测定OD540吸光值流水冷却后，加蒸馏水20mL。空白管

7、：在25mL试管中依次加入1mL底物溶液、3mLDN、1mL对应浓度的酶溶液。时间时，迅速取2mL反应液于装有3mLDNS试剂的25mL试管中（取两次，每次时间间隔相同），迅速振荡均匀。↓G作酶反应进程曲线4.3实验注意事项①反应温度准确，酶液准确稀释。不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释②试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；③移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。④精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；⑤避免试管进水：煮沸和用流水冲洗

8、时；5、实验结果与数据处理：5.1实验数据与结果：如表一OD540值时间(min)酶浓度mg/ml0.20.40.60.830.39950.26750.52600.711560.65600.34050.72901.064090.81700.54751.00101.2330120.93800.66101.13701.2730151.01200.70801.15601.2930201.09700.81551.29301.4340251.16900.90301.36201.5520301