纤维素酶最适反应温度的测定

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1、本科学生实验报告学号104120434姓名穆志国学院生命科学学院专业、班级10生物技术实验课程名称纤维素酶最适反应温度的测定指导教师及职称李俊俊＿＿＿＿开课时间2012至＿2013学年＿下学期填报时间2013年4月17日一、实验目的1、了解不同温度条件对酶活性的影响2、掌握酶最适反应温度的测定方法二、实验原理温度对酶促反应速率的影响有两方面：一方面，温度升高可加快分子运动速率，提高分子碰撞概率，从而使反应速率加快；另一方面，温度升高可能使酶蛋白逐步变性而失活，从而降低酶促反应速率。温度对酶促反应速率的影响是

2、这两方面作用的综合结果。所以只有在某一温度范围内时，酶促反应速率才会随着温度的升高而升高，达到最大反应速率时的温度称为酶作用的最适温度（OptimumTemperature）。将其它条件（如酶浓度、底物浓度、pH、反应时间等）固定在最适状态，然后在一系列不同温度条件下进行酶活力测定。绘制得到温度——酶活力曲线。酶的最适温度并不是酶的特征常数，受其它因素的影响。三、实验试剂1、柠檬酸钠缓冲液，0.05mol/LpH4.（适用于酸性纤维素酶）2、磷酸缓冲液，0.1mol/LpH6.0（适用于中性纤维素酶）3、C

3、MC-Na溶液（底物溶液，pH4.8和pH6.0）4、DNS试剂（CMCA-DNS）5、纤维素酶液（pH4.8和pH6.0）四、实验仪器1、分光光度计2、沸水浴3、恒温水浴（100±0.1）℃4、分析天平（感量0.1mg）5、移液器6、计时器7、磁力搅拌器五、实验方法1、本实验在室温至90℃之间选择不同温度测定酶活力，以找出纤维素酶在此条件下的最适温度。2、待测酶液制备称取固体纤维素酶1g，精确至0.1mg，用蒸馏水溶解，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差落在0.2—0.5范围内，不在此范围内，酶液

4、要进行重新稀释），待测。3、测定步骤（1）取3支25mL刻度具塞试管（1支做空白管，2支做样品管）。（2）分别向3支管中准确加入用相应pH缓冲液配制的CMC-Na溶液2.00mL注意：加入CMC-Na溶液时应缓慢，不可粘在试管壁上。（3）分别准确加入稀释好的待测酶液0.5mL于2支样品管中（空白管不加）用涡旋混合器混匀。（注意：酶液一定要垂直加在底物上面，不可顺着试管壁加入）（4）将3支试管同时置于不同温度水浴中，准确计时，反应30min，取出。（5）迅速准确地向3支管中加入3mLDNA试剂（加液顺序和加酶

5、液顺序相同以保证反应时间相同），振荡摇匀，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.5mL，摇匀。将3支管同时放入沸水浴中，准确计时，煮沸10min取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。（6）以空白管调零，在分光光度计540nm波长下，用1cm比色皿，分别测量2支样品管中样液的吸光度OD值，分别记为ODE1、ODE2，取二者平均值。带入标准曲线方程计算酶活力。注意：不同温度指室温、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃4、纤维素酶酶活力计算纤维素酶酶活力（U/g）=(K×平均OD+b)×N/

6、0.5×0.5式中：K——标准曲线的斜率b——标准曲线的截距N——试样的总稀释倍数0.5——反应酶液的体积，mL0.5——反应时间，h酶活力的计算值保留3位有效数字注意：同一试样两个平行测定值的相对偏差在±8%以内，二者的平均值为最终的酶活力测定值。5、葡萄糖标准曲线图一:葡萄糖标准曲线（注：在前面的实验中已经测得，可以沿用前面中实验所得的结果）三、实验结果（1）、实验所测得的数据温度（℃）平均OD值平均OD值（PH=4.8）平均OD值（PH=6.0）室温（约为26℃）0.22050.0685300.284

7、50.2475400.28300.340500.38300.2205600.39550.189700.50250.145800.4390.089900.0820.049表一：在不同温度条件下，当PH值分别为4.8和6.0是测得的吸光度注：当温度为50℃和60℃时，使用的酶液稀释倍数为10000倍，而其它的温度时刻，稀释的倍数都是为5000倍（2）、应用公式进行计算酶活，可以得到下表①当Ph=4.8时温度（℃）酶活（u/ml)室温（约为26℃）2025.12302834.08402815.12508158.2

8、4608474.24705589.6804786.9690274.48表二：PH=4.8时，不同温度下的酶活②当PH=6.0时温度（℃）酶活（u/ml)室温（约为26℃）103.84302366.4403535.6504050.24603253.92701070.880362.9690-142.64表二：PH=6.0时，不同温度下的酶活③为更直观的表示，纤维素酶在不同温度下的变化，做出如下散点图图二：不同温度下的