酶工程实验报告一(纤维素酶活力测定)

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1、本科学生实验报告本科学生实验报告仅供参考责任自负学号104120440姓名孙永升学院生命科学学院专业、班级10生物技术实验课程名称酶工程<实验>教师及职称李俊俊<讲师>开课学期2012至2013学年第二学期填报时间2013年4月9日云南师范大学教务处编印15实验名称实验方式小组成员实验一、纤维素酶活力测定小组合作XXXXXXXX1、实验目的1.1学习并了解纤维素酶的基本特性；1.2学习酶活力的测定方法；1.3学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度计的使用方法；1.4学会对实验数据的处理及实验报告的撰写；2、实验仪器、试剂和溶液：A2仪器：A2.1滤纸酶活力(FP

2、A)的测定中仪器：除普通实验室仪器外，还应有:分光光度计、酸度计精度士0.01pH、恒温水浴(50士0.l)0C、分析天平感量0.1mg、磁力搅拌器、秒表或定时钟、沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成)、具塞刻度试管25mL。A2.2羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS)测定中仪器：自动连续多档分配器、漩涡混合器试管、水浴等仪器同A2.1B2试剂和溶液(除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。)B2.1葡萄糖标准曲线制备：①葡萄糖标准贮备溶液(10mg/mL)：称取于(103士2)℃下烘千至

3、恒重的无水葡萄糖1g,精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL,②葡萄糖标准使用溶液：分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0.00,1.00,1.50,2.00,2.50,3.1500,3.50mL于10mL容量瓶中，用水定容至10mL，盖塞，摇匀备用。上述系列浓度应根据需要自行调整。B2.2滤纸酶活力(FPA)的测定中用到的试剂和溶液：①DNS试剂：称取3,5一二硝基水杨酸(10士0.1)g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠l0g，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水

4、定容至1000mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。②柠檬酸缓冲液，0.05mol/LpH4.8(适用于酸性纤维素酶)：称取一水柠檬酸4.83g,溶于约750mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g,用水定容至1000mL。调节溶液的pH到(4.8士0.05)备用。③磷酸缓冲液，0.1mol/LpH6.0(适用于中性纤维素酶)：分别称取一水磷酸二氢钠121.0g和二水磷酸氢二钠21.89g，将其溶解在10L去离子水中。调节溶液的pH到(6.0士0.05)备用。溶液在室温可保存一个月。⑥快速定性滤纸(杭州新华一号滤纸)沪15cm(每批滤纸，使用

5、前用标准酶加以校正)。B2.3羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS)测定用到的试剂和溶液：①竣甲基纤维素钠(CMC-Na)：化学纯(上海光华化学试剂厂)在25℃,2%水溶液，粘度800mPa.s-1200mPa.so(每批羧甲基纤维素钠使用前用标准酶加以校正)。②柠檬酸钠缓冲液，同上。③磷酸缓冲液，同上。④CMC-Na溶液：称取2gCMC-Na,精确至1mg，缓缓加入相应的缓冲液约200mL并加热至800℃-900℃，边加热边磁力搅拌，直至CMC-Na全部溶解，冷却后用相应的缓冲液稀释至300mL，用2mol/L盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH到(4.8士0

6、.05)(酸性纤维素酶)或(6.0士0.05)(中性纤维素酶)，最后定容到300mL,搅拌均匀，贮存于冰箱中备用。⑤DNS试剂同上。153、实验原理及实验流程或装置示意图：A3滤纸酶活力(FPA)的测定原理:纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。B3羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS)测定原理：纤

7、维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(狡甲基纤维素钠)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3,5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的CMCA-DNS酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。C3实验流程:葡萄糖标准曲线制作滤纸酶活力(FPA)的测定羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS)测定D3酶活定义D3.1纤维素酶：在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。D3.2滤纸酶活力Filte